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目的:
建立有效的脂质体瞬时转染法,转染小分子干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)沉默人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stemcells,hUC-MSCs)内B7-H1(PD-L1)的表达。
方法:
设计、化学合成针对B7-H1基因的4组siRNA分子序列,采用阳离子脂质体法瞬时转染hUC-MSCs,运用实时荧光定量PCR、Western-blot方法从mRNA、蛋白水平检测hUC-MSCs内B7-H1的表达。
结果:
4组特异性B7H1-siRNA序列(B7H1-homo-256组、 B7H1-homo-325组、B7H1-homo-689组、B7H1-homo-799组)与NC对照组在转染6h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光,转染效率分别为75%、80%、82%、84%、78%。在转染后24h、48h均有效地抑制了B7H1基因在mRNA和蛋白水平的表达。48h时,Real-time PCR检测mRNA,B7H1-homo-689组抑制效率最高,达(81.33-6)%。48h时,Western-blot检测hUC-MSCs内B7H1蛋白表达中空白对照和阴性对照组的表达不受影响。B7H1-homo-689组与转染试剂对照组相比,蛋白表达抑制最显著,抑制率达58%。
结论:
靶向B7H1的siRNA分子片段可以有效地抑制hUC-MSCs内B7H1的表达,为后续相关研究提供实验方法。