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目的本项目拟从细胞实验、动物实验和临床组织标本三个方面,探讨丹参酮ⅡA是否可以通过m~6A修饰介导的miRNA调控来抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡,以及进一步探究其中的作用机制,为临床应用丹参酮ⅡA制剂治疗肝癌提供更加可靠的理论和实验依据,以利于更加科学地防治肝癌。方法1利用肝癌术后组织标本及配对的癌旁组织做miRNA表达谱芯片,选用肝癌细胞株经丹参酮ⅡA处理后做同样的芯片。运用生物信息学方法分析两组芯片,选取差异miRNAs,取交集,得出一个共有的miRNA——miR-125a-5p。2通过Western blot、qRT-PCR、数据库差异基因挖掘、CCK8、平板克隆形成和免疫荧光等实验,探究miR-125a-5p对肝癌细胞增殖与凋亡的影响,以及丹参酮ⅡA对miR-125a-5p的作用。3通过qRT-PCR实验,探究丹参酮ⅡA对pri-miR-125a-5p作用。通过Dot blot、ELISA和qRT-PCR等实验,检测经丹参酮ⅡA处理后的肝癌细胞中m~6A总体水平,以及m~6A修饰相关蛋白“Writers”和“Erasers”的mRNA水平,确定其中发挥m~6A修饰作用的蛋白。通过qRT-PCR、co-IP、Me-RIP和RIP等实验,探究该蛋白是否可以通过m~6A修饰调控miR-125a-5p的表达。4通过数据库挖掘、生物信息学分析、Western blot、Luciferase和qRT-PCR等实验,筛选并验证miR-125a-5p靶基因。通过CCK8、平板克隆形成、免疫荧光和Western blot、裸鼠皮下移植瘤、免疫组化等实验,探究miR-125a-5p通过靶基因介导的信号通路抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡的作用机制,以及丹参酮ⅡA对该通路的影响。结果1通过芯片差异基因分析,得到一个共有基因miR-125a-5p。并且发现,在肝癌组织中miR-125a-5p的水平明显降低,经丹参酮ⅡA处理后,miR-125a-5p的表达则又显著升高。我们推测,miR-125a-5p可能是抑癌基因。2 miR-125a-5p表达在肝癌组织、细胞及数据库中都是下调的。进一步实验发现,miR-125a-5p通过升高促凋亡蛋白P53、Bax、caspase-3表达,下调抑凋亡蛋白Bcl-2表达,最终抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。并且,丹参酮ⅡA上调miR-125a-5p的表达,丹参酮ⅡA抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡可能与上调miR-125a-5p的表达相关。3丹参酮ⅡA可以降低pri-miR-125a-5p的表达,上调miR-125a-5p的表达。经丹参酮ⅡA处理后,肝癌细胞中m~6A总体水平升高,m~6A相关蛋白中只有METTL14 mRNA的表达升高。进一步研究发现,METTL14过表达,介导m~6A结合DGCR8,促进miR-125a-5p的成熟,上调miR-125a-5p的表达。4 PTPN1和MAP3K11是miR-125a-5p的靶基因。miR-125a-5p通过靶向PTPN1和MAP3K11介导JNK通路的调控。体内外实验表明,miR-125a-5p通过降低靶基因PTPN1和MAP3K11的表达,下调JNK通路中关键蛋白JNK1/2/3及下游c-Jun的表达水平,从而抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。同时发现,丹参酮ⅡA抑制PTPN1和MAP3K11,以及JNK通路中的JNK1/2/3和c-Jun的表达,升高促凋亡蛋白P53、Bax、caspase-3表达,降低抑凋亡蛋白Bcl-2表达。结论丹参酮ⅡA通过上调METTL14的表达,介导m~6A结合DGCR8,促进miR-125a-5p成熟,上调miR-125a-5p的表达,抑制靶基因PTPN1和MAP3K11的表达,进而降低JNK通路中关键蛋白JNK1/2/3及下游c-Jun的表达水平,最终上调促凋亡蛋白P53、Bax、caspase-3表达,降低抑凋亡蛋白Bcl-2表达,促进肝癌细胞凋亡。