骨肉瘤是最常见的一种原发恶性骨肿瘤，好发于儿童及青少年。尽管目前肿瘤边缘外彻底手术切除联合新辅助化疗的标准治疗手段已经使骨肉瘤患者的5年生存率提高到50-65%，但仍有一些原发在特殊部位、早期转移或化疗抵抗的骨肉瘤患者预后不佳，且传统化疗对患者的毒副作用不可忽视。肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体（TRAIL）能特异性地诱导肿瘤细胞凋亡，而不影响正常细胞。然而，TRAIL在体内循环时间短，清除快，如果能通过构建特异性表达TRAIL的DNA质粒（pTRAIL），转染肿瘤细胞，使细胞自身持续性表达TRAIL，将大大提高TRAIL的治疗效率。鼠双微体2（Mdm2）是抑癌基因p53的负调控基因，在p53基因缺陷或变异的肿瘤细胞中几乎都有Mdm2基因的过表达，因此，通过基因干预的方式降低肿瘤细胞Mdm2基因表达水平将能发挥有效的抑瘤作用。基因转染载体是决定基因治疗效果的关键因素之一。聚酰胺树形分子（PAMAM）作为一类非病毒基因转染载体，材料尺寸均一可控，表面有较优的电荷条件，具有相对较低的细胞毒性，且表面大量的功能基团可提供更大的改造空间。我们前期通过在第五代PAMAM（G5）表面修饰2,4-二氨基-1,3,5-三嗪（DAT），合成G5-DAT66，已经证明在多种细胞系中都具有比商业化转染试剂更高的基因转染效率和血清稳定性。因此，在本课题中，我们将研究G5-DAT66分别转染pTRAIL和Mdm2-siRNA对骨肉瘤的基因治疗作用。一、G5-DAT66在骨肉瘤MG-63细胞中的pEGFP转染效率及G5-DAT66/pTRAIL的制备和表征目的：明确G5-DAT66转染载体对骨肉瘤MG-63细胞基因转染的适用性，以及G5-DAT66/pTRAIL复合物的基因转染潜能。方法：通过“一步反应法”合成G5-DAT66，并通过核磁表征，确认合成产物。分别筛选G5-DAT66/pEGFP、G5/pEGFP、SuperFectamineTM（SuperFect）/pEGFP和Lipofectamine2000TM（Lipo2000）/pEGFP复合物转染MG-63细胞的最佳氮磷比（N/P）。通过流式细胞仪统计比较在最佳N/P条件下形成的G5-DAT66/pEGFP、G5/pEGFP、SuperFect/pEGFP和Lipo2000/pEGFP复合物转染MG-63细胞后的EGFP表达阳性细胞比率和平均荧光强度值。制备G5-DAT66/pTRAIL复合物，并用动态光散射仪检测不同N/P条件下形成复合物的纳米尺寸和Zeta电势。结果：通过核磁1H NMR和COSY谱确认G5-DAT66产物合成成功。G5-DAT66/pEGFP、G5/pEGFP、SuperFect/pEGFP和Lipo2000/pEGFP复合物的最佳转染N/P分别为14、8、3μL/μg DNA和2.5μL/μg DNA。G5-DAT66/pEGFP组的EGFP表达阳性细胞比率和平均荧光强度值明显高于其余三组（P<0.01）。在N/P8之后，G5-DAT66/pTRAIL复合物的尺寸稳定在400nm以下，在N/P16之后，复合物则稳定为200nm左右；在N/P8之后，复合物Zeta电势稳定在+45mV左右。结论：G5-DAT66在骨肉瘤MG-63细胞中同样有高效的pEGFP转染效率。G5-DAT66能与pTRAIL在N/P8~16以上条件下形成合适尺寸的稳定的总体带正电荷的复合物，具有进一步细胞基因转染的潜能。二、G5-DAT66转染pTRAIL对MG-63细胞的抑制作用目的：研究G5-DAT66在MG-63细胞中的pTRAIL转染效率，以及转染后的细胞凋亡诱导和生长抑制效果。方法：通过MTT实验筛选G5-DAT66/pTRAIL、G5/pTRAIL、SuperFect/pTRAIL和Lipo2000/pTRAIL复合物转染MG-63细胞的最佳氮磷比（N/P）。利用最佳N/P条件下形成的各组复合物转染MG-63细胞，通过MTT实验比较转染后各组细胞的增殖率；通过Annexin V-FITC/PI双染实验，标记凋亡细胞，比较各组细胞的凋亡比率；通过Western-blot实验比较各组细胞TRAIL蛋白、Cleaved Caspase-8蛋白和p53蛋白的表达水平；通过RT-PCR实验比较各组细胞TRAIL mRNA、p53mRNA和p21mRNA的表达水平。结果：相比于其他对照组，G5-DAT66/pTRAIL转染后的MG-63细胞增殖率最低（P<0.001）；凋亡细胞的比率最高；TRAIL蛋白、Cleaved Caspase-8蛋白和p53蛋白的表达水平最高；TRAIL mRNA、p53mRNA和p21mRNA（P<0.05）的表达水平最高。结论：G5-DAT66在MG-63细胞中中具有比G5、SuperFect和Lipo2000更高的TRAIL质粒转染效率，且通过更高水平的TRAIL及相关凋亡标记物的表达，而实现更高效的细胞凋亡和生长抑制效果。三、G5-DAT66转染pTRAIL对MG-63多细胞肿瘤球体（MTS）的抑制作用目的：MTS是一种能模拟体内实体瘤生物特性的体外多细胞3D培养模型。研究G5-DAT66在MG-63细胞MTS上的基因转染效率，以及转染pTRAIL对MTS凋亡诱导和生长抑制的作用，为进一步体内基因治疗应用提供证据。方法：G5-DAT66、G5、SuperFect、Lipo2000分别与pEGFP形成复合物转染MG-63细胞MTS，在激光共聚焦显微镜下观察比较各组MTS在不同深度层面的EGFP荧光细胞数量和分布。G5-DAT66、G5、SuperFect、Lipo2000分别与YOYO-1标记的pTRAIL形成复合物，与MTS分别作用2、6、24h后，在激光共聚焦显微镜下观察比较各组复合物在MTS中心截面的穿透深度。以PI染色标记G5-DAT66/pTRAIL、SuperFect/pTRAIL、Lipo2000/pTRAIL转染后的MTS中的凋亡细胞，在激光共聚焦显微镜下观察比较各组MTS在不同深度层面的PI染色细胞的数量和分布，并通过监测MTS的体积变化，比较各组MTS的生长速率。结果：G5-DAT66/pEGFP组MTS在不同深度层面上都比其余各组MTS有更多的EGFP荧光细胞分布。G5-DAT66、G5和pTRAIL-YOYO-1形成的复合物比SuperFect、Lipo2000在MTS中心截面有更深的穿透距离。G5-DAT66/pTRAIL组MTS在不同深度层面上都比其余各组MTS有更多的PI染色细胞分布，且MTS末次测量的体积倍增幅度比其余各组更小（P<0.05）。结论：G5-DAT66比G5、SuperFect、Lipo2000在MG-63细胞MTS上有更高的pEGFP转染效率，且相对于SuperFect和Lipo2000，G5和G5-DAT66载体的穿透能力更强。相比SuperFect和Lipo2000，G5-DAT66转染pTRAIL对MTS有更强的凋亡诱导和生长抑制作用。四、G5-DAT66转染Mdm2-siRNA对MG-63细胞的抑制作用目的：研究G5-DAT66在骨肉瘤MG-63细胞中的Mdm2-siRNA转染效率以及对MG-63细胞的凋亡诱导和生长抑制作用。方法：分别以Lipo2000/Mdm2-siRNA和不同N/P条件下形成的G5-DAT66/Mdm2-siRNA复合物转染MG-63细胞，通过RT-PCR实验比较各组细胞Mdm2mRNA的表达水平；通过Western-blot实验比较各组细胞Mdm2蛋白、p53蛋白、Caspase-8蛋白的表达水平；通过Annexin V-FITC/PI双染实验，标记凋亡细胞，用流式细胞仪统计各组凋亡细胞分布；通过MTT实验，比较转染后各组细胞的增殖率。结果：N/P82条件下形成的G5-DAT66/Mdm2-siRNA/82复合物转染后的MG-63细胞Mdm2mRNA、Mdm2蛋白表达最低，p53蛋白、Caspase-8蛋白的表达最高，凋亡细胞的比率最高，细胞增殖率最低（P<0.01）。结论：G5-DAT66在MG-63细胞上转染Mdm2-siRNA能发挥比Lipo2000更高的Mdm2基因干扰效率，以及更强的凋亡诱导和生长抑制效果。