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研究背景支气管哮喘是常见的慢性疾病，研究哮喘的分子病理机制是有效控制哮喘的前提。针对哮喘的遗传学基础、与环境因素的关系、免疫机制等研究证实哮喘是受遗传和环境因素影响的复杂的多基因疾病。同时也发现很多尚不明了和有争议的问题，其中关于嗜酸性粒细胞（eosinophils，EOS）的作用是最大的争论焦点之一。EOS是哮喘发病机制中主要的效应细胞，在哮喘发病过程中阻断嗜酸粒细胞浸润理应取得很好的疗效，但目前在临床上除了糖皮质激素通过多个环节上抑制哮喘气道炎症而取得良好的疗效之外，所有单纯针对嗜酸粒细胞的治疗都收效甚微。因此，哮喘中EOS在活化、迁移、发挥炎症效应过程中细胞内部信号转导调节、分子调控机制以及这些细胞内部分子调控与细胞活化、迁移、发挥其在哮喘中病理作用的关系有待进一步探讨。我们实验室从哮喘发作过程中EOS基因差异表达入手，希望发现哮喘发作过程中EOS某些有意义的表达变化的基因，以及这些基因表达变化可能调控哪些EOS功能。我们前期应用抑制消减杂交技术成功构建了哮喘发作与缓解外周血EOS cDNA消减文库，并初步筛选出56个差异表达基因，其中包括上调基因“弹弓”基因（Slingshot，SSH）。SSH基因是2002年在果蝇的遗传研究中发现的，其表达的SSH磷酸酶是一种专用的丝切蛋白磷酸酶，目前对其研究才刚起步，而关于其在EOS中的定位、表达及功能方面的研究还未见报道。方法1、以正常自愿者15例、未经糖皮质激素（glucocorticoids，GCs）治疗的急性发作期患者15例、已经予GCs治疗的缓解期患者15例为研究对象。2、应用Percoll不连续密度梯度法分离正常人及哮喘患者外周血EOS，裂解细胞，Trizol提取总RNA，RT-PCR方法在基因水平验证SSH-1L差异表达。3、裂解细胞EOS，提取蛋白质，应用Western Blotting方法在蛋白质水平验证哮喘外周血EOS SSH-1L差异表达。4、应用免疫荧光检测SSH-1L在正常人和哮喘患者外周血EOS中的定位。5、哮喘患者在GCs治疗前后外周血EOS SSH-1L在基因和蛋白水平的对比。6、加入地塞米松孵育哮喘患者外周血EOS，检测GCs对SSH-1L在基因水平表达的影响。7、所有原始数据采用SPSS 10.0软件的One Way ANOVA（LSD／S-N-K或Dunnett T3）或独立样本t检验进行统计学分析。结果1、外周血EOS计数：正常组（0.100×109±0.045×109）／L，治疗组（0.120×109±0.047×109）／L，未治疗组（0.210×109±0.125×109）／L；未治疗组与正常组及治疗组比较均显著升高（P=0.015、P=0.041），治疗组与正常组比较无显著差异（P=0.712）。2、RT-PCR：外周血EOS的SSH-1L／β-Actin灰度值比分别为：正常组0.2464±0.1085，治疗组0.2777±0.1120，未治疗组0.5939±0.2197；未治疗组与正常组及治疗组比较均显著升高（P=0.000、P=0.000），治疗组与正常组比较无显著差异（P=0.821）。3、Western blot：外周血EOS蛋白样品SSH-1L／β-Actin灰度值比：正常组0.9461±4-0.1522，治疗组0.6170±0.1880，未治疗组0.5718±0.3143；未治疗组与正常组及治疗组比较均显著升高（P=0.024、P=0.042），治疗组与正常组比较无显著差异（P=0.761）。4、利用免疫荧光对SSH-1L在正常人和哮喘患者外周血EOS的定位，发现并证明正常人和哮喘患者外周血EOS SSH-1L均定位在胞浆中，在贴近胞壁中丰富表达。5、哮喘患者在GCs治疗前后外周血EOS SSH-1L在基因和蛋白水平的对比：（1）外周血EOS RT-PCR扩增SSH-1L基因的SSH-1L／β-Actin灰度值比：治疗前0.7403±0.1124，治疗后0.4101±0.0363，治疗前后有显著差异（P=0.001）；（2）外周血EOS蛋白样品的SSH-1L／β-Actin灰度值比：治疗前0.3410±0.1337，治疗后0.1543±0.0551，治疗前后有显著差异（P=0.039）。6、加入地塞米松孵育外周血EOS RT-PCR扩增SSH-1L基因的SSH-1L／β-Actin灰度值比：对照组0h为0.4574，24h为0.4269，48h为0.2294；地塞米松组0h为0.4469（与对照组同一时间段比较基本相同），24h为0.3213（与对照组同一时间段比较明显减低），48h为0.1813（与对照组同一时间段比较较明显减低）。结论1、在基因和蛋白质水平验证SSH-1L在哮喘急性发作病人外周血EOS上调差异表达，提示EOS SSH-1L表达上调可能与外周血EOS迁移有关。2、外周血EOS SSH-1L定位在胞浆中，在贴近胞壁中丰富表达，提示SSH-1L的表达与其调控EOS迁移有关。3、在基因和蛋白质水平发现经GCs治疗的病人外周血EOS中SSH-1L表达与正常自愿者无显著差异，经GCs治疗的病人治疗前后SSH-1L表达有显著差异，推测GCs可能通过抑制哮喘急性发作期EOS中SSH-1L表达而抑制EOS的激活、迁移起到治疗作用。4、通过加入GCs孵育对哮喘患者外周血EOS SSH-1L在基因水平表达减弱再次说明GCs可能通过抑制哮喘急性发作期EOS中SSH-1L表达而抑制EOS的激活、迁移。