第一部分:单核细胞增殖李斯特菌Imo2088蛋白的晶体结构及性质探究单核细胞增殖李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种食源性的胞内寄生革兰氏阳性致病菌,依靠其约200个调控基因组成的复杂网络能够对外部环境产生高度适应性。这些调控蛋白被进一步分类为不同的家族。其中,Tet R/Acr家族调控因子在不同基因的调控中起到至关重要的作用。Lmo2088基因是TetR/Acr家族的一员,通过下游基因lmo2087编码的MATE外排泵调节多药和有毒化合物的外排。本研究的重点是单核增生李斯特菌中推定TetR/AcrR家族转录调控因子lmo2088的结构解析。将编码带有C端6XHis标签的lmo2088蛋白质全长序列克隆到NdeI和XhoI酶切的pET30a表达载体上,构建载体转化到DH5 α菌株中进行复制,之后转化到BL21和Rosetta菌株中进行蛋白表达。Lmo2088蛋白使用亲和层析和凝胶排阻层析法分离纯化。纯度均一的蛋白使用气相扩散悬滴法进行晶体筛选,在进行结晶条件优化后获得单晶晶体,并进行衍射数据收集。X射线衍射数据收集于上海同步辐射光源。晶体衍射分辨率为1.7 A,使用XDS程序对X射线衍射数据进行处理。硒代标记的晶体使用单波长反常散射法进行收集并使用Autosol-Phenix测定相位,同时,天然晶体结构以硒代甲硫氨酸标记蛋白为模型,通过分子置换法测定结构。使用Phenix-refine程序进行结构模型的优化,使用COOT程序对模型进行手动修正。最终模型的原子坐标文件提交至PDB数据库(PDB ID:5ZTC)。在本研究中,我们确定了一个单增李斯特菌TetR/AcrR家族转录调节因子lmo2088的结构。结构表明,该调控蛋白由两个不同的结构域组成:携带DNA结合位点的N端螺旋-转角-螺旋(HTH)基序和C端效应结构域。为了测定一致性DNA结合位点,我们通过SELEX技术筛选了 DNA结合序列,并通过荧光偏振、等温滴定量热法和凝胶电泳阻滞迁移率法进一步验证了其与蛋白的亲和能力。我们发现筛选出来的命名为y795H1的25 bp一致性DNA序列与转录调节因子lmo2088结合较好。作为对比,一个命名为X333的随机选择的25 bp DNA与lmo2088表现出较低的亲和力。荧光偏振法和等温滴定法结果一致。我们推测,结构上的理解可能有助于确定单核增生李斯特菌lmo2088调控因子的调控机制。第二部分:单核细胞增殖李斯特菌假定转录因子Imo2131转化和结晶单核细胞增生李斯特菌是普遍存在的食源性病原体。单核细胞增生李斯特氏菌因其具有由200多个转录调节因子建立的复杂的调控网络而非常能够适应变化的环境条件。此外,转录调节子又分为不同的家族。在这些调节家族中,cAMP受体蛋白/富马酸酯硝酸还原酶调节蛋白家族在基因调节中起着重要作用。Crp家族因子充当基因或基因组的激活剂。Lmo2131来自单核细胞增生李斯特氏菌Crp蛋白质家族。迄今为止,lmo2131的结构和功能尚不清楚。当前的研究集中于lmo2131的结构确定。为了确定结构和功能,通过亲和色谱和凝胶色谱法纯化在大肠杆菌BL21细胞中过表达的lmo2131蛋白。蒸气扩散悬滴法用于蛋白质结晶。将低温冷却的单晶用于X射线衍射数据收集。分别收集了两套晶体衍射数据,分辨率分别为1.9 A和2.1 A。为了鉴定lmo2131的共有DNA序列,用SELEX方法对该蛋白进行了人工合成的长为66 bp的DNA文库筛选。对筛选到的DNA寡核苷酸库进行测序,并将共有序列鉴定为蛋白结合靶标。我们推测对功能和结构的了解将有助于开发针对多药耐药单核细胞增生李斯特菌菌株的药物设计。