检测动物皮毛中6种致病菌的基因芯片技术研究

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本研究根据WHO、OIE等权威机构公布的各国疾病流行情况和相关的文献资料,结合实验室病原分离、鉴定结果,以动物皮毛中常见的6种致病菌布氏杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、丹毒杆菌、铜绿假单胞杆菌等为研究对象,选择16srDNA基因和gyrB基因进行序列分析,设计两对通用引物和相应的多条细菌鉴别探针,研究同时检测6种致病菌的基因芯片检测方法,并进行实际应用效果评价。主要研究内容和结果如下:1.在对动物皮毛携带布氏杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、丹毒杆菌、铜绿假单胞杆菌等鉴定的基础上,采用CTAB法,酚氯仿法、NaI法和NaOH-SDS法分别提取6种致病菌的核酸,比较提取核酸含量、纯度和完整性,发现:酚氯仿法可作为基因芯片检测的通用核酸提取方法。2.选择在细菌生物学上具有重要意义的16s rDNA基因和gyrB基因,对6种致病菌的序列分析后分别设计2对通用引物和对应的1~5条特异性寡核苷酸探针,每条上游引物标记TAMARA荧光基团。使用芯片点样液将各个探针稀释为30μmol/L,点样制备检测基因芯片,每个矩阵为18×10阵列(行×列),每条探针5个重复点。建立每种细菌基于16s rDNA基因和gyrB基因的通用不对称的PCR方法,其产物与制备基因芯片杂交,优化并建立同时检测6种致病菌的基因芯片方法。结果表明:基因芯片最佳反应条件为使用47%甲酰胺杂交液,42℃杂交4h。该芯片的检测方法特异性好,仅与布氏杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、丹毒杆菌、铜绿假单胞杆菌等菌发生特异性反应,与蜡样芽孢杆菌、苏云金杆菌、大肠杆菌O152、李斯特杆菌、沙门氏菌和阪崎肠杆菌不产生假阳性反应。方法的灵敏度最低可达10拷贝数核酸。3.随机选取163份动物皮毛样品进行基因芯片检测,对杂交阳性样品进行细菌分离鉴定或相应的特异性PCR方法检测,检测符合率为100%,表明建立的动物皮毛中携带致病菌的基因芯片检测方法适合临床样品的批量检测。
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