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转录因子是DNA结合蛋白质,通过与被调控靶基因启动子区域的顺式作用元件特异性结合,从而调控目标基因在细胞中的表达强度、表达时间和组织特异性。乙烯响应因子（Ethylene responsive factor,ERF）作为AP2/EREBP转录因子家族的一个亚族,也是植物特有的一类转录调节因子,是植物细胞信号转导系统中重要的基因表达调控蛋白,在生物和非生物胁迫响应中调节植物的基因表达过程中起重要作用。本研究在实验室前期工作基础上,通过克隆马铃薯StERF5转录因子基因并对其进行了生物信息学分析,利用酵母双杂交技术筛选St ERF5基因下游互作蛋白质,首次成功地挖掘了马铃薯StERF5转录因子的互作功能基因,取得的研究结果如下:1.利用电子克隆获得马铃薯转录因子的St ERF5基因序列,设计带有酶切位点的特异性引物,以马铃薯品种“紫花白”的RNA经RT-PCR合成双链cDNA为模板,扩增马铃薯转录因子St ERF5基因。测序结果表明,该序列与GenBank注册的马铃薯序列（XP015169356）同源性达100%,该基因全长1240 bp,开放阅读框架738 bp,编码245个氨基酸,其中100-163为AP2保守结构域,属于EREBP亚族中ERF类成员,编码的蛋白不具有信号肽,属于非分泌型亲水性蛋白质。2.用EcoRI和Bam HI双酶切St ERF5基因片段和p GBK T7空载体,连接,构建诱饵载体pGBKT7-StERF5,将p GBKT7-StERF5通过醋酸锂法导入活化的酵母菌株Y2HGlod中,一周后对实验组和对照组的菌落进行毒性检测。结果表明,诱饵质粒pGBKT7-St ERF5和空质粒pGBKT7在SD/-Trp培养基平板上的菌落生长数量基本一致,同时在5 h、10 h、15 h、20 h、25 h和30 h测得其OD600均大于0.8,说明诱饵载体pGBKT7-StERF5对酵母菌Y2HGlod细胞没有毒性作用,可以用作进一步的酵母双杂交实验。3.将构建的诱饵载体pGBKT7-St ERF5转化酵母细胞Y2HGlod中,分别在不同营养缺陷性培养基上进行鉴定分析。结果表明,在SD/-Trp（色氨酸缺陷型）和SD/-Trp/X-ɑ-Gal（色氨酸缺陷型附加X-ɑ-Gal）固体培养基上阳性对照pGBK T7-53+pGADT7-T和阴性对照p GBK T7-Lam+pGADT7-T均可以生长,并且诱饵载体也能够正常生长,因此可以判断重组诱饵载体对酵母pGBKT7载体的下游报告基因MEL1和AUR1没有自激活性,在SD/-Trp/X-ɑ-Gal/Ab A（含金担子素）固体培养基上阳性对照能生长外,阴性和实验组未有菌落的生长,表明诱饵载体对MEL1和AUR1报告基因无自激活作用。因此本实验构建的诱饵载体pGBK T7-StERF5可以进行下一步互作蛋白的筛选实验。4.将诱饵载体pGBK T7-StERF5与马铃薯干旱胁迫下的酵母文库c DNA杂交融合/共转化,筛选与目的蛋白互作的候选蛋白,最后经筛选和检测得到三个与马铃薯StERF5互作的蛋白,在NCBI数据库中,进行cDNA测序比对确认这三个蛋白质分别为组蛋白H2B、特异性蛋白磷酸酶、R3H型单链核酸结合蛋白。对筛选的互作蛋白进行分析比对,发现它们与番茄具有很高的同源性,高达90%以上,进行GO分析后显示三个互作的候选蛋白定位在不同的细胞中,对马铃薯响应干旱的信号代谢通路可能产生一定的作用。5.通过阳性克隆的质粒（pGADT7-X）与构建的p GBKT7-StERF5重组质粒进行回转杂交,再次鉴定组蛋白H2B与马铃薯中的ERF转录因子确实可以发生互作反应,进一步的互作机制将来可借助双分子荧光互补、免疫共沉淀共同验证互作候选分子如何招募其转录因子进行基因表达调控。