在人群中,人源巨细胞病毒(HCMV)感染者非常普遍,但多数人在儿童或青少年时期被HCMV感染后获得免疫力。随着免疫低下人群(艾滋病、放射损伤、恶性肿瘤等患者)的日益增多,HCMV感染引发的疾病也越发常见,特别对胎儿及孕妇的影响最为严重。这促使人们更加重视对HCMV的分子生物学、流行病学和临床诊断学等方面的研究。机体被病毒感染后,宿主细胞会快速启动免疫应答以抵抗病毒的入侵;与此同时,病毒也进化出了一系列的分子策略用于逃避宿主细胞的免疫应答,实现免疫逃逸从而促进病毒自身的复制。病毒感染能否导致宿主产生疾病主要取决于宿主免疫反应与病毒逃避宿主免疫反应之间的斗争结果。机体的免疫反应可分为天然免疫和获得性免疫两种方式。其中,天然免疫反应是宿主防御病原微生物入侵的第一道防线。病原微生物感染机体后,宿主细胞通过自身遗传表达的模式识别受体(PRRs)识别病原微生物来源的病原相关分子模式(PAMPs)并激活下游一系列信号通路,最后诱导I型干扰素和下游抗病毒基因的表达,介导宿主抗病毒天然免疫反应。DNA病毒感染机体后,病毒释放到细胞质中的病毒DNA被胞质DNA受体环腺苷酸合成酶(cGAS)识别,并激活cGAS。活化的cGAS催化ATP和GTP合成环化二核苷酸(cGAMP)。产生的cGAMP作为第二信使结合到内质网(ER)相关的衔接蛋白MITA(也称为STING)并将其活化。活化状态的MITA离开内质网经高尔基体最终转移到核周的点状聚集体或微粒体上。在此转运过程中,MITA招募激酶TBK1和转录因子IRF3进而形成复合体。IRF3进而被TBK1磷酸化,并以二聚体形式进入细胞核,最终诱导I型干扰素和下游抗病毒基因表达。据文献报道,HCMV感染宿主细胞后,主要通过cGAS-MITA介导的信号转导过程诱导I型干扰素的产生。目前为止,是否存在HCMV蛋白可以靶向cGAS-MITA介导的信号转导过程实现病毒免疫逃逸尚不清楚。因此,在该研究中我们系统性地筛选能够抑制cGAS诱导的IFNβ表达的HCMV蛋白。根据前期的筛选结果,我们选择UL82和UL44作为深入研究的候选蛋白。第一部分研究结果表明,UL82可以显著抑制HCMV和HSV-1感染以及转染核酸模拟物HSV120和B-DNA诱导的宿主抗病毒天然免疫反应,但不影响SeV感染诱导的天然免疫信号转导。无论是敲低还是敲除UL82蛋白的表达以后,都能显著上调HCMV感染引起的天然免疫反应。荧光素酶报告基因实验结果表明,UL82剂量依赖性地抑制cGAS或MITA诱导的ISRE报告基因的激活,但不影响TBK1或IRF3介导的ISRE的激活。另外我们还发现,UL82虽然抑制MITA介导的抗病毒基因及炎症因子的表达,但并不影响HCMV和cGAMP诱导的MITA寡聚化。进一步研究表明,L82与MITA和iRhom2相互作用,其中UL82(194-372aa)截短体以及MITA的C端(151-379aa)是两个蛋白作用的关键结构域。激光共聚焦显微镜和CO-IP实验结果表明,UL82通过破坏MITA-iRhom2-TRAPβ易位复合物的形成从而抑制活化的MITA从ER向核周转移。GST Pull-down实验结果证明,UL82直接削弱了 MITA对TBK1和IRF3的募集。UL82缺陷型HCMV诱导下游抗病毒基因的表达显著高于野生型HCMV组,而野生型HCMVLCUL82缺陷型病毒具有更强的复制能力。综合以上实验结果表明,UL82通过拮抗MITA介导的抗病毒免疫反应来促进HCMV免疫逃逸。第二部分研究结果表明,UL44(HCMVDNA聚合酶)是一个负调控宿主天然免疫应答的蛋白。在HFF细胞中,过表达UL44能够抑制病毒,核酸模拟物以及炎症因子诱导的抗病毒基因的表达。敲低UL44增强HCMV诱导的宿主细胞天然免疫反应。空斑实验结果表明,过表达UL44明显增强HSV-1和VSV的复制能力。生化实验结果表明,UL44不影响抗病毒天然免疫信号转导过程中关键蛋白的磷酸化变化。但UL44抑制IRF3和p65等关键蛋白介导的ISRE,IFNβ或NF-κB报告基因的激活。综合以上结果表明,UL44的功能与细胞核内IRF3和p65相关。进一步研究结果表明,UL44主要通过抑制I型干扰素及其下游抗病毒基因的表达来促进DNA和RNA病毒复制。UL44的156-290(DNA binding domain)和L86/87氨基酸残基在其拮抗宿主免疫应答中起着关键的作用。这些研究结果揭示了 HCMV实现免疫逃逸的重要机制,这将为HCMV感染导致相关疾病的治疗以及药物和疫苗的研发提供了分子靶标和理论依据。