研究背景与目的流行病学显示,世界范围内人类生育力呈明显下降趋势,不孕症发病率达到15%-20%。北京大学乔杰院士课题组调查表明:1988年我国不孕症发生率为6%,2014年上升至18%,中国不孕人口占世总不孕症人群的1/4-1/3,达2000-3000万对。国际卫生组织人类生殖规划署认为,不孕症已与心脑血管疾病、恶性肿瘤并列为影响人类健康的三大疾病。因男性因素所致不育约占其中的50%,而无精子症是其疑难重症。无精子症分为睾丸前、睾丸后与睾丸性无精症三种类型。因睾丸因素导致的非梗阻性无精子症,所占比例最高而且病因不明。随着基因组测序技术与组织病理检测技术的不断发展,全外显子测序以及全基因组测序已经广泛运用于肿瘤等代谢性疾病,但在不育研究中刚刚起步。本研究旨在运用NGS技术与睾丸组织整体染色技术,揭示无精子症相关的新的遗传变异类型以及新的突变位点,构建无精子症患者生育力评估新方法;探索精原干细胞增殖分化的机制,为无精子症患者重建生育力提供理论基础与研究平台。材料与方法一、基于全外显子测序,阐释特发性NOA致病位点临床选择特发性NOA,排除已知遗传与感染等病因。根据其病理类型(SCOS、MA以及HS),经知情同意,入组本研究。抽取外周血DNA,行全外显子测序(WES),经生物信息学分析,寻找致病位点。进而Sanger技术验证,cyto-SCAN检测患者CNV变异,体外构建点突质粒,同时转染空载质粒、过表达质粒以及点突质粒,检测致病点突对蛋白功能影响,揭示NOA致病基因。二、多位点免疫荧光整体染色新技术评估生精小管精子发生临床选择接受显微男科手术的OA与NOA患者,获取睾丸组织,利用整体染色技术对无精子症患者的生育力进行评估,同时对这些无精子症睾丸组织行HE染色及免疫荧光染色,对比整体染色与传统方法评估生育力准确性、时效性与经济性优劣。三、人精原干细胞鉴定分离与转录组学研究从OA患者中鉴定分离人精原干细胞以及分化型精原细胞,对比精原干细胞增殖与分化过程中的转录组特征,生物信息学分析筛选SSCs增殖调控的关键基因。四、FGF5调控精原干细胞增殖作用与分子机制基于课题组前期研究,提示FGF5是SSCs增殖的关键基因。通过CCK-8、EDU、磷酸化蛋白芯片、免疫印迹技术,研究FGF5调控精原干细胞增殖的作用和机制。结果一、本研究入组NOA患者357例,通过全外显子测序,发现8个致病基因17个新位点,并经Sanger测序验证。进一步HE染色、免疫组化证实其临床表型与基因型一致。通过cyto-SCAN验证了生精阻滞新的突变模式,CNV杂合缺失加上杂合单碱基移码突变的突变模式,通过体外构建其SYCE1以及SYCE1突变质粒,分别转染293T,对细胞进行蛋白抽提,WB结果显示SYCE1突变质粒相较于SYCE1过表达载体,条带大小降低、表达含量减少,提示突变为该患者的致病原因。通过对比SCO、MA以及HS三组患者致病基因发生概率,发现MA的发生概率远远大于SCOS以及HS两组。二、本研究建立多位点生精小管整体染色新技术,对57例无精子症患者的睾丸生精小管进行生育力评估,其中OA 14例,NOA 43例。对比HE染色、免疫荧光染色结果,发现染色结果一致。但新的生育力评估技术快速准确,能够更精确评估是否存在生精细胞及其类型。整体染色技术可以作为新型的无精子症生育力检测方法。三、本研究通过对精原细胞分子标记物染色,鉴定人精原干细胞。利用膜表面标记物(GFRA1、FGFR3以及KIT)进行MACS分选,分别获取人精原干细胞与分化型精原细胞。抽提RNA,RT-PCR验证其纯度,并进行转录组学研究,鉴定两种精原细胞特异表达基因。四、本研究经CCK8以及EDU实验表明,FGF5促进精原干细胞的自我更新与增殖。磷酸化蛋白芯片与免疫印迹实验表明,FGF5激活PI3K-AKT以及MAPK通路,对精原干细胞进行自我更新调控。结论本研究紧密结合男性不育临床,基于全外显子测序技术与多位点组织整体染色技术,建立男性生育力生殖遗传评估新方法。对357例特发性非梗阻性无精子症,进行外周血测序,发现与无精子症相关的8个致病基因的17个新致病位点与致病新模式。本研究创新性运用组织整体染色技术,对生精小管精子发生过程进行评估,相比于传统方法,整体染色技术广泛、快速、准确,临床应用前景广阔。本论文基于新的精原细胞标志物,成功鉴定分选人精原干细胞,并探讨其转录组特征,揭示FGF5通路为SSCs增殖与自我更新的关键新通路,为人精原干细胞在体外长期培养提供新靶点。本研究为精子发生研究提供新的实验依据,为无精子症患者生育力重建提供新方法。