马尾松PmDXR基因的克隆与功能分析

来源 :南京林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:whimco1984
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马尾松作为我国重要的采脂树种,为我国松脂相关的可再生资源提供起到重要作用。松脂的主要成分是萜类化合物,马尾松萜类化合物的合成可依赖MEP途径合成前体物质,再经一系列酶促反应生成各种萜类物质。DXR是此途径上游的关键酶,对萜类物质的合成与积累具有重要调控作用。为初步研究马尾松PmDXR基因的功能,本论文首先通过PCR技术获得PmDXR基因序列,并通过实时荧光定量分析其表达模式;其次,通过亚细胞定位和遗传转化实验初步验证PmDXR基因功能;最后,克隆获得PmDXR基因的启动子序列并构建表达载体,通过瞬时表达初步验证PmDXR基因启动子的功能。主要研究结果如下:(1)利用PCR和RACE技术克隆得到PmDXR基因的全长序列1994bp,其ORF序列为1584bp,共编码527个氨基酸。理化性质分析发现PmDXR蛋白相对分子质量为57.43kD,等电点(pI)为6.36,为稳定的疏水性蛋白。蛋白质二级结构预测结果表明PmDXR蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主。跨膜结构预测分析显示PmDXR蛋白的30-527位氨基酸位于细胞膜表面。密码子分析表明PmDXR基因密码子比较偏好以A/T结尾,且PmDXR基因在编码氨基酸时密码子使用偏好性较弱。在NCBI中比对PmDXR的完整cDNA序列发现,PmDXR基因与火炬松、赤松、思茅松的相似度较高。氨基酸序列多重比对结果表明,PmDXR与其他植物DXR均有2个DXR功能结合基序和2个高度保守的NADPH结合位点结合基序。(2)PmDXR基因在马尾松不同组织中的qRT-PCR结果表明,PmDXR在马尾松木质部中的表达量最高,其次为成熟叶和根中,在花中表达量最低。不同胁迫处理下qRT-PCR分析表明,PmDXR基因的表达受机械损伤的诱导。激素诱导qRT-PCR分析表明,SA、ETH、MeJA处理后PmDXR基因的表达量在多数情况下较对照均有所下降。(3)通过注射法将PmDXR-GFP载体瞬时转化至本氏烟草,激光共聚焦显微镜下观察发现PmDXR-GFP定位在烟草叶表皮细胞的叶绿体中。(4)将PmDXR基因转入拟南芥中,经抗性筛选和分子水平检测获得转基因拟南芥植株。分别测定野生型拟南芥和转基因拟南芥的DXR酶活性与光合色素含量,结果表明PmDXR超表达拟南芥的DXR酶活性、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量较野生型均有提高。正常生长30d的转基因及野生型拟南芥的莲座没有明显差异。干旱处理拟南芥15d发现,转基因拟南芥缺水15d时的生长状况较野生型好,在复水3d后,野生型与转基因拟南芥均能逐渐恢复。将野生型和转基因拟南芥种子点播在含不同浓度Na Cl、ABA、MeJA、D-Mannitol的培养基上生长10d后发现,低浓度处理时,野生型与转基因拟南芥的根生长所受影响均较小,高浓度处理时,转基因拟南芥根生长所受抑制与野生型相比略轻。但整体来看,各处理条件下,野生型与转基因拟南芥所受影响并无显著差异,推测过表达DXR基因未提高拟南芥对高浓度Na Cl、SA、MeJA的耐受性。(5)克隆获得PmDXR基因启动子序列1600bp,顺式作用元件预测表明PmDXR基因启动子含有多种顺式作用元件。构建pBI121-ProDXR表达载体在烟草中进行瞬时表达,GUS染色结果表明,PmDXR基因启动子可以驱动GUS基因在烟草根、茎、叶中表达,其中茎中的染色颜色较根和叶中略浅。用不同激素处理侵染后的烟草,GUS染色结果表明经ABA、MeJA处理后,PmDXR基因启动子驱动的GUS染色效果强于未作处理的烟草叶片,GA处理后GUS染色效果与未作处理相较略弱。本论文克隆得到PmDXR基因及其启动子序列的全长,其功能初步分析表明PmDXR在萜类物质合成中发挥重要作用,可为进一步揭示马尾松萜类物质合成的分子调控提供帮助。
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