棉花GhOTUD5基因的表达及其互作蛋白研究

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雄性不育是植物杂种优势利用的基础,其机理的研究一直是植物遗传育种重要的热点之一。细胞质雄性不育是高等植物的一种重要生物学性状,其产生的机理极其复杂,至今尚未得到完全解析。雄性不育的形成与育性相关基因在一定时空上的表达及其参与的复杂生理生化过程有关。组蛋白的共价修饰是调节基因表达的中心环节。目前已有相关研究表明组蛋白的泛素化与去泛素化水平与植物的生殖发育密切相关,其与育性的关系已经在拟南芥、小麦、水稻等植物中进行了研究,棉花中相关内容的研究鲜有报道。本实验室前期已经以棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系为研究材料,克隆出组蛋白去泛素化酶GhOTUD5基因,并对其进行了生物信息学分析及转录水平上基因表达的研究。本研究构建了棉花GhOTUD5基因的原核表达系统,并进行表达与纯化;从棉花晋A细胞质雄性不育系总蛋白中筛选出与GhOTUD5具有相互作用的蛋白质,并对互作蛋白进行克隆与互作关系的进一步验证。结果如下:1.采用POE-PCR方法,构建了重组表达载体pET-22b-GhOTUD5,并在E.coli Transetta(DE3)中表达,纯化GhOTUD5蛋白并进行质谱鉴定。纯化得到了GhOTUD5蛋白,其分子量为59.481k D。2.采用His pull-down技术,从棉花晋A细胞质雄性不育系总蛋白中筛选出与GhOTUD5具有相互作用的蛋白质,并进行质谱分析。以质谱鉴定结果中的肽段覆盖率、得分、肽段匹配数等为筛选标准,共找到8个可能与GhOTUD5蛋白相互作用的蛋白质。它们分别是V型质子ATPase催化亚基A、T-复合蛋白1亚基alpha、T-复合蛋白1亚基zeta 1、T-复合蛋白1亚基eta、T-复合蛋白1亚基theta、V型质子ATPase亚基B1、V型质子ATPase亚基B2和V型质子ATPase亚基D。其中可以归为3类蛋白:V型质子ATPase催化亚基、T-复合蛋白1亚基和V型质子ATPase亚基。3.以棉花晋A细胞质雄性不育系为材料,进行潜在互作蛋白的克隆。本试验克隆出GhVHA-D基因cDNA序列长度为786bp,编码一条含有261个氨基酸残基的多肽。采用POE-PCR方法,构建了重组表达载体p GEX-4T-1-GhVHA-D,在E.coli Transetta(DE3)中表达,纯化GhVHA-D蛋白并进行质谱鉴定。纯化得到了GhVHA-D蛋白,其分子量为29.262k D。采用GST pull-down技术,对GhVHA-D蛋白与GhOTUD5蛋白进行体外互作关系验证。初步确定GhVHA-D蛋白与GhOTUD5蛋白具有相互作用。4.采用同源克隆的方法,克隆出赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶GhLDL1基因cDNA序列,并进行生物信息学分析。棉花晋A细胞质雄性不育系GhLDL1基因cDNA序列长度为2337bp,编码一条含有778个氨基酸残基的多肽,其分子量为85.487k D。GhLDL1具有亲水性,没有信号肽,是一个可以跨膜的不稳定蛋白。通过亚细胞定位预测GhLDL1蛋白主要在细胞质中发挥作用,细胞核和叶绿体中也存在少量GhLDL1蛋白。采用POE-PCR方法,构建了重组表达载体p GEX-4T-1-GhLDL1,并在E.coli Transetta(DE3)中表达,纯化GhLDL1蛋白并进行质谱鉴定。纯化得到了GhLDL1蛋白,分子量为85.487k D。采用GST pull-down技术,对GhLDL1蛋白与GhOTUD5蛋白进行体外互作关系验证。初步确定GhLDL1蛋白与GhOTUD5蛋白具有相互作用。5.采用双酶切的方法,构建过表达载体pRI101-AN-GhOTUD5,通过农杆菌介导的花序侵染法,将过表达载体导入拟南芥,获得T1代和T2代转基因拟南芥株系。
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