山羊瘤胃和草鱼肠道微生物分子生态研究及β-葡萄糖苷酶基因的克隆

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:huangguohao123
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动物胃肠道存在着大量的微生物群落,构成了动物消化道微生物区系,这些微生物群落是动物长期进化的结果,它们和机体的免疫功能、营养需求等都有着密切的关系。微生物生态的监测及其群落多样性分析是微生物生态学研究所采用的重要技术手段和内容。基于核酸序列分析的现代分子生物学技术可以用来检测不可培养微生物的种类,完善微生物的分类系统,从而更真实的反映环境微生物的群落结构。植食性动物胃肠道存在大量可降解纤维素和半纤维素的微生物,分泌并应用大量纤维素降解酶类。因此,对于植食性动物胃肠道微生物的分子生态、纤维素酶类多样性及功能研究在理论研究和生产实践中具有重要的意义。本研究应用变性梯度凝胶电泳技术研究动物胃肠道微生物分子生态。利用16S rDNA,rpoB和原虫18S rDNA基因的变性梯度凝胶电泳技术对三种山羊(波尔山羊、内蒙古绒山羊、四川南江黄羊)瘤胃细菌以及原虫的优势菌群结构进行了比较分析。研究结果显示rpoB DGGE图谱中条带数目少于16S rDNA图谱,并且条带分离效果明显,更有利于分析瘤胃细菌群落组成。DGGE图分析显示,三种山羊瘤胃细菌均具有一定的相似性,种内个体间相似性明显高于种间相似性,这说明宿主品种是影响瘤胃细菌种群构成的一个重要因素。而原虫种内相似性并不高于种间相似性。利用同样方法对草鱼肠道不同区段优势菌群结构进行了比较分析。研究结果表明消化道存在着丰富多样的细菌群落,对DGGE指纹图谱聚类分析表明菌群组成相似性高于77%。其中中肠和后肠的细菌多样性高于前肠,这可能与摄食饵料在消化道推移有关。另外,以饲喂单一牧草的草鱼肠道为研究对象,筛选到具有不同纤维素酶活性的菌株90多株。然后根据菌落形态和水解圈差异结合16S rDNA序列结果,最终分离到15株具有不同纤维素水解能力的细菌菌株。基于16S rDNA序列比对分析发现,分离菌株分别属于希瓦氏菌属(Shewanella)、气单胞菌属(Aeromonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proleus)、肠杆菌属(Enterobacter)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)。进一步建立了一种快速筛选和评价属于糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶编码新基因的方法。β-葡萄糖苷酶是一种能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键的水解酶,在纤维素降解领域具有重要的应用价值。通过对发表酶氨基酸序列的同源比较,设计了一对简并引物,利用同源克隆技术,在15株细菌中克隆得到11条编码β-葡萄糖苷酶的基因片段,其相互之间氨基酸相似性在50%到98%之间。实验结果证实了这种快速筛选基因方法的有效性。通过基因组文库筛选,从芽孢杆菌属、气单胞菌属和变形杆菌属中分别获得了三个β-葡萄糖苷酶基因的全长序列,分别命名为bgl3,bgl5和bglZ7,这三个基因同已注册的葡萄糖苷酶基因序列的最高相似性分别为88%、72%和82%。它们与已报道的进行过功能验证的来源于Clostridium cellulovorans的BglA氨基酸相似性最高,分别为36.4%、35.4%、34.6%,说明它们是新的β-葡萄糖苷酶基因。
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