背景、目的和意义 大肠癌(colorectal cancer，CRC)是严重威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤之一。由于大肠癌的发生发展是一种多基因、多因素、多步骤的复杂过程，目前尚未发现其相当特异的分子病理改变和肿瘤标志物，在其早期诊治研究中普遍面临的问题是缺乏特异、准确、简便的生物学指标和实用方法。 自90年代初噬菌体抗体库(phage antibody library)技术出现以来，该技术使得人们从应用DNA重组技术改造现有的单抗发展到利用基因工程技术克隆新的抗体分子。在感染性疾病的诊治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗，抗原表位分析以指导疫苗分子的设计、新型药物设计、蛋白分子免疫识别机制的研究等多个领域显示出巨大的潜能和广阔的应用前景。作为功能性小分子抗体片段，Fab包括重链VH-CH1(Fd段)和完整的轻链，两者通过一个链间二硫键连接，是完整抗体的三分之一。Fab具有与抗体相近的抗原结合活性，因其分子量小、穿透性强、抗原性低，可在原核系统表达以及易于基因工程操作等优点而受到人们的重视。 目前所知的与大肠癌相关的抗体不仅有限，而且特异性不高。寻找高特异性、高亲和性的大肠癌抗体已成为学者们所关注的热点之一。随着分子生物学的发展，基因芯片技术的运用，为寻找到大肠癌较特异性的抗原提供了可能。 本课题采用噬菌体抗体库及基因芯片等前沿生物学技术，以大肠癌患者外周血淋巴细胞为材料，构建人大肠癌自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库。从基因芯片筛选出来的通过初步验证与大肠癌特异性相关的基因蛋白抗原，大肠癌组织混合抗原以及CEA抗原作为固相抗原，从噬菌体抗体库中筛选、富集抗大肠癌相关抗体，为大肠癌的特异性诊断和免疫治疗提供新的手段，并为进一步利用这些抗体筛选大肠癌相关基因并研究其功能提供库源。 材料与方法 一、噬菌体抗体库的构建 1.RT一PCR扩增抗体K、人轻链和重链Fd段基因片段:分离大肠癌患者的外周血淋巴细胞并提取其总RNA。逆转录合成CDNA第一链，相应引物配对进行PCR，扩增抗体K、人轻链和重链Fd段基因片段。 2.抗体K、人轻链PCR产物重组入噬粒载体pComb3:轻链PCR产物经分离纯化与pComb3分别以适量Sacl/X为al双酶切后进行连接。纯化的连接产物转化感受态XLI一b lue细胞扩增后提取噬粒，即得到轻链基因库噬粒。以适量(1。时，l时，0.1夙)转化细菌菌液铺板，以测定转化率。挑取单克隆，提质粒后双酶切鉴定重组效率。 3.噬菌体抗体Fab呈现库的构建:同样的方法把重链Fd段基因PCR产物克隆到轻链基因库噬粒中得到噬菌体抗体全基因库(Fab抗体基因库)。向上述Fab抗体基因库中加入辅噬菌体VCSM13，超感染后制备成Fab噬菌体呈现原始库。测定其库容量及进行初步鉴定。 二、基因芯片筛查大肠癌相关基因 1.提取4例大肠癌患者手术切除的大肠癌及其正常大肠粘膜组织标本的总RNA。 2.上述总RNA进行反转录，同时用Cy3/Cys标记反应产物。 3.标记好的产物与基因芯片进行杂交反应。经过扫描和数据处理后，得到大肠癌基因表达情况。 4.挑选与大肠癌最相关的基因进行RT一PCR验证。结果好的基因(JUNB基因)购买对应蛋白抗原(JUNB蛋白抗原)。 三、利用噬菌体抗体库筛选有关人源性噬菌体抗体 1.将筛选用大肠癌组织混合抗原、CEA抗原、JUNB抗原包被酶标板。 2.用我们构建的噬菌体抗体库与包被的抗原进行4轮“吸附一洗脱一扩增”的淘选反应，同时测定各级库的滴度，用以判断富集程度。 3.挑取最后一轮淘选后在LB平板上生长的单菌落，经VCSM13超感染后制备单菌落噬菌体Fab抗体。 4.以Ca 125抗原作为特异性对照，采用EL工SA法检测上述用大肠癌相关抗原(大肠癌组织混合抗原、JUNB蛋白抗原、CEA抗原)淘选出来的单克隆噬菌体抗体与相应抗原的结合活性。 5.从上述每种抗原的单克隆噬菌体抗体中各挑选一个与相应抗原结合反应较好的克隆，进行Fab基因的序列测定及序列同源性分析。结果一、噬菌体抗体库的构建 1.从20ml的外周血中分离出2x107个淋巴细胞，提取到高纯度的总RNA，经RT一PCR扩增出68Obp的轻链及重链基因产物。轻链PCR产物混合后重组入噬粒载体pComb3，构建了库容量为4.02 X IJ的轻链基因库，酶切鉴定重组率为80%，故实际轻链表达载体基因库的库容量为4.02 x IJx8O%=3 .216x1)。 2.将PCR扩增的重链Fd段基因重组入轻链重组质粒中的相应位点，得到抗体Fab段基因库。测定库容量为2.1又IJ。酶切鉴定均可切出轻重链基因片段的重组体为50%，实际抗体Fab段表达载体基因库中均有轻重链基因的容量为2 .1 xl。下x 50%二1 .05 x 107。 3.通过对噬菌体抗体呈现原始库的点印迹鉴定提示所构建的噬菌体原始库具有Fab的呈现。 二、基因芯片筛查大肠癌相关基因 运用基因芯片筛选4例大肠癌和癌旁正常肠粘膜组织差异表达的基因，按照我们的数据筛选标准，芯片结果中有1807个基因发生了显著性变化，其中上调表达的基因有936个，最有显著性上调的有36个;下调表达的基因