目的:中风是中老年人群中的高发病,具有高致残率、致死率的特点,虽然可用组织纤溶酶原激活物(Tissue plasminogen activator,t-PA)治疗,但t-PA只有很短的治疗时间窗(3～4.5h),并有出血转化、神经毒性以及增加死亡率的副作用[1]。因此寻找更加有效的治疗策略与药物具有重要意义。网络药理学是新型发展起来的的现代新药研究范式,强调“网络靶标”在生物网络、生物通路中的动态调节作用,具有整体性、系统性、动态性的特点,与中医的整体观、辨证论治特色不谋而合,是中医复方现代化研究的强有力策略与方法,为深入探索中药复方的“君臣佐使”组方机理、“异病同治”内涵,治病作用机制等研究提供了有力工具。当归芍药散(Danggui-Shaoyao-San,DSS)出自《金匮要略》,由当归、芍药、川芎、白术、茯苓、泽泻组成,具有补血活血、化瘀逐痰的功效,自20世纪80年代至今,在中风和神经退行性疾病治疗方面,表现出潜在的临床应用价值[2,3]。本论文主要针对当归芍药散治疗缺血性中风的作用机制研究,一方面采用网络药理学方法,从分子层面阐明了 DSS的“君臣佐使”、“异病同治”的生物学基础,从整体观出发,探讨了 DSS治疗缺血性中风的作用机制;另一方面基于大鼠中动脉栓赛(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)缺血性中风模型,观察当归芍药散水提液与乙醇提取液对脑缺血再灌注损伤急性期的整体疗效差异(源于当归芍药散原方原义),在此基础上,以网络药理学方法所探索的当归芍药散治疗疾病所涉及的内涵基础上,进一步深入探索当归芍药散乙醇提取物对脑缺血再灌注损伤的可能作用机制,最后采用高效液相色谱-紫外法(High performance liquid chromatography-ultraviolet,HPLC-UV)探索当归芍药散乙醇提取物中主要活性成分含量。方法:实验一:基于网络药理学探索当归芍药散治疗缺血性中风的作用机制研究我们通过权威中草药数据库与文本挖掘方法构建DSS的化学成分数据库;以吸收(Absorption,A)、分布(Distribution,D)、代谢(Metabolism,M)、排泄(Excretion,E)为参数,筛选DSS中的活性成分;随后采用随机森林和支持向量机两种算法对筛选的活性成分进行靶点预测;采用InteractiVenn网站与GluGO插件分别对作用靶点进行了协同机制、分子功能与生物过程分析;构建活性成份、靶点、通路、疾病之间的相互作用网络;应用Cytoscape软件对以上构建的各种网络做可视化处理;最后对复杂网络做相关的网络分析,尽可能全面的挖掘其中蕴含的生物学意义。实验二:基于MCAO模型大鼠探索当归芍药散对缺血性中风的保护作用机制研究当归芍药散中的当归、芍药、川芎、白术、茯苓、泽泻以3:16:4:8:4:8的比例混合,一部分用于制作水煎剂:适量药材8倍体积的蒸馏水浸泡1小时,煎煮1小时,收集滤液,滤渣再以6倍体积蒸馏水煎煮1小时,收集滤液并充分混合两次滤液,最后冷冻干燥保存备用;一部分用于DSS乙醇提取物制备:70%乙醇以10倍量比浸泡过夜,超声提取3次(1小时/次),合并三次提取液冷冻干燥备用。选择270～290g的雄性SD大鼠,参考Longa,et.法建立大鼠MCAO模型。本实验共涉及有5组实验动物,即假手术组(SHAM)、模型组(MCAO)、DSS水提液组(DSS/W)、DSS乙醇提取物组(DSS/E或者DSS),以及SIRT1 特异性抑制剂EX527处理组(MCAO+EX527+DSS),其中 DSS/W 与 MCAO+EX527+DSS 组各 6 只,SHAM 组 1 4只,其他组各21只大鼠。各组大鼠在再灌注前30min给与相应处理:SHAM与MCAO组给与等体积的双蒸水灌胃处理,DSS/W、DSS/E(DSS)以及MCAO+EX527+DSS实验组分别给与12g/kg(生药量/体重)的当归芍药散水提液或乙醇提取物治疗(而MCAO+EX527+DSS在造模前已给予EX527处理)。大鼠处死前参考modifin ed Neurological Severity Score(mNSS)法给与神经功能缺损评估。术后24h取脑组织,一部分脑组织应用TTC染色法观察脑组织梗死面积大小,并进一步充分利用此脑组织进行相关蛋白的检测:同时参考Garcia的方法评估大鼠脑组织的脑水肿情况(只有在进行DSS不同提取物对MCAO模型大鼠脑水肿影响差异试验时使用)。另一部分进行冰冻组织切片,采用TUNEL染色法检测脑组织皮质与纹状体细胞凋亡情况,免疫荧光法观察3NT,采用HET、HKSOX-1探针观察脑组织中活性氧情况;采用Western Blot(WB)法检测脑组织蛋白 Caspase3、Ceaved-caspase3、Bcl2、Bax 蛋白的表达,观察神经元死亡情况;WB法检测P47phox、P67phox、iNOS、以及SIRT1蛋白的表达情况,观察脑组织氧化应激情况。实验三:采用HPLC-UV检测当归芍药散乙醇提取物中主要活性成分含量以当归芍药散乙醇提取物中的主要活性成分为研究对象,采用HPLC-UV技术,应用安捷伦色谱柱(Eclipse Plus C18,4.6×250mm.5μm),乙腈(A)与 0.05%磷酸水(B)作为流动相,进行梯度洗脱。流动相A:B=95%-88%:5%-12%(0-15min):15-25min时的流动相A 88%等度洗脱;25-60min流动相A从88%变为75%;60-80min流动相A从75%变为45%;80-100min流动相A从45%变为30%;100-120min流动相A从30%变为5%;120-130min流动性A5%等度洗脱;130-138min流动相A从5%变为95%;138-145min流动相A95%等度洗脱。流速为1ml/min,柱温为25℃,进样量5ul,检测波长为230nm。进行系统适用性检测后,根据线性关系检测得到当归芍药散中芍药苷、芍药内脂苷、阿魏酸含量。结果:实验一:基于网络药理学探索当归芍药散治疗缺血性中风的作用机制研究本实验采用网络药理学探索当归芍药散对缺血性中风疾病的作用机制,结果表明,DSS作为中药复方所具有的“多成分-多靶点-多途径”的内涵有:DSS中有52活性成分,可作用于248个蛋白靶点,在这些靶点中,川芎与白芍各有特异性靶标58(24.07%)、40(16.60%)个,当归虽然只有2个特异性靶点,但是其他靶点主要与川芎以及白芍重合(分别有56、25个),由此可知当归可通过这些相同的作用靶点协同增强白芍与川芎的治疗作用,同时白芍与川芎也有相互协同作用,说明它们在治疗疾病起其主要作用,其他中药在DSS中起次要治疗作用。当归芍药散的“异病同治”基础是DSS同时对中风、神经退行性疾病、呼吸系统疾病、泌尿生殖系统疾病、免疫系统疾病等有治疗作用,是因为这些疾病间有相同的治病蛋白以及分子机制。具体而言,而DSS通过多种途径参与缺血性中风的治疗,主要包括调节谷氨酸兴奋性毒性,线粒体与内质网功能紊乱、以及神经炎证等相关病理通路而对缺血性中风具有治疗作用。实验二:基于MCAO模型大鼠探索当归芍药散对缺血性中风的保护作用机制研究本实验采用MCAO模型大鼠探索当归芍药散提取物对脑缺血再灌注损伤急性期的的保护作用机制。结果表明,在神经功能缺损评估方面,与MCAO模型大鼠相比,DSS水提液(DSS/W,12g/kg)组大鼠灌胃治疗后,大鼠的mNSS评分并没有减少,而给与DSS乙醇提取物(DSS/E,12g/kg)灌胃干预后,大鼠的mNSS评分明显减少(P<0.05);在脑梗死范围大小的影响方面,与MCAO模型大鼠相比,DSS/W组大鼠的梗死面积没有减少,而DSS/E组大鼠的脑梗死面积显著减少(P<0.05):在脑水肿影响方面,与MCAO模型大鼠相比,DSS的水提物与乙醇提取物干预均未对脑水肿有治疗作用。由此可知,DSS乙醇提取物比水提物对MCAO模型大鼠的整体疗效更为明显,因此在深入机制研究方面,我们只采用了 DSS乙醇提取物继续探索对MCAO的作用机制研究。结果表明,与SHAM组相比,DSS乙醇提取物(DSS,12g/kg)灌胃治疗后,DSS可显著减少大脑皮层与纹状体区域的凋亡神经元数目,明显减少Bax蛋白表达(P<0.05),上调Bc12蛋白表达,下调Cleaved-caspase3/caspase3蛋白表达;在分子机制层面,与MCAO模型大鼠相比,DSS在再灌输前30min干预后,大鼠脑组织中的活性氧O2-、3NT含量可显著减少,对脑组织中的P46phox、P67phox、iNOS蛋白表达呈下调趋势,而可显著上调SIRT1蛋白表达;当采用SIRT1特异性抑制剂时,DSS对MCAO模型大鼠的缺血再灌注损伤保护作用消失。实验三:采用HPLC-UV检测当归芍药散乙醇提取物中主要活性成分含量本实验采用HPLC-UV法探索当归芍药散乙醇提取物中主要活性成分含量测定。结果表明,系统适用性良好,对照品线性关系良好。经HPLC测定并计算得出芍药苷、芍药内脂苷、阿魏酸的含量分别为39.7412ug/mg,5.3411ug/mg,0.8221ug/mg。结论:(一)基于网络药理学的研究结论1.DSS中医复方“多成分-多靶点-多途径”的具体内涵主要涉及:DSS有52个活性成分,可作用于248个蛋白靶点;分子水平的“君臣佐使”内涵与中医理论相符;“异病同治”的生物学基础是DSS同时作用于多种疾病的共同致病靶标与分子机制。2.DSS主要通过调节谷氨酸兴奋性毒性、线粒体与内质网稳态、钙离子稳态以及神经炎证等病理过程对缺血性中风具有治理作用。由此可知,网络药理学应用于中医复方研究的优点在于它既可以宏观把握复方的复杂性,又可以从微观角度探秘复方复杂性的内在机理,一大一小,一动一静,可以使中医复方以及所蕴含的中医理论从模糊性走向具体化,可以为治疗疾病提供更多的智慧。(二)基于MCAO模型大鼠以及HPLC-UV法的研究结论1.DSS乙醇提取物比DSS水提物对脑缺血再灌注损伤MCAO模型大鼠的整体疗效更好。2.DSS乙醇提取物对脑缺血再灌注损伤急性期的保护作用主要通过抗氧化应激作用,其机制具有SIRT1依赖性。3.HPLC-UV方法操作简单、快捷,准确、重复性好,可用于检测DSS复方中的主要活性成分芍药苷、芍药内脂苷、阿魏酸的含量。综上所述,当归芍药散乙醇提取物对脑缺血再灌注损伤急性期的保护作用比水提液更好,可通过抗氧化剂应激(具有SIRT1依赖性)、抑制神经元凋亡,减少脑梗死灶大小,缓减MCAO模型大鼠神经功能缺损情况;当归芍药散乙醇提取物中主要活性成分芍药苷、芍药内脂苷、阿魏酸的含量分别为39.7412ug/mg,5.3411ug/mg,0.8221ug/mg。