论文部分内容阅读
早期胚胎中普遍存在染色体非整倍体现象是导致辅助生殖技术(Assisted reproductive technology, ART)治疗结局不理想的主要原因。目前,ART主要通过胚胎形态评分法选择优质胚胎进行移植,但不能排除非整倍体胚胎。胚胎植入前染色体非整倍体筛查(preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening, PGS)在体外受精(In vitro fertilization-embryo transfer,IVF/Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)过程中借助荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)技术,对第3天胚胎进行活检分析,筛选出遗传正常的胚胎移植入母体子宫,将提高胚胎种植率,降低流产率,并能减少生育三体患儿的风险。目前,国内的相关研究报道较少,且多数仅选用X、Y或21号染色体探针,进行胚胎性别和三体诊断,而提高种植率及降低流产率则至少需选用8条染色体(即13,15,16,18,21,22,X和Y染色体)探针。另外,分析精子中的非整倍体率,可为正确评估患者生育子代的遗传风险提供依据。关于克氏征嵌合型患者精子非整倍体的研究报道较少,另外,关于ART中常用的精液优化处理方法能否降低性染色体非整倍体患者精子中的非整倍体率,目前尚未见报道。本研究拟建立用11种不同的染色体探针(在8条探针基础上,增加1,7,17号染色体探针)对单卵裂球进行FISH分析的PGS技术,并对第3天胚胎中的嵌合体现象进行探讨。同时,对克氏征嵌合型患者的精子进行染色体非整倍体分析,并比较分析嵌合型克氏征患者及超雄综合征患者精液未经优化处理及经密度梯度离心法、上游法处理后的精子非整倍体率。研究分为三个部分进行。第一部分FISH在性染色体非整倍体患者外周血标本中的检测目的：建立应用三组杂交对11种染色体(1,7,13,15,16,17,18,21,22,X,Y染色体)进行检测的淋巴细胞FISH技术；比较克氏征嵌合型患者的外周血FISH结果与G现代核型分析结果。方法：培养收获正常男性外周血淋巴细胞,将11条探针分为三组混合,即PB探针(含13,16,18,21,22号染色体探针)、混合探针1(含X,Y及17号染色体探针)及混合探针2(含1,7,15号染色体探针),进行FISH杂交,若信号不理想,则调整探针浓度或实验条件；培养收获三例克氏征嵌合体患者的淋巴细胞,应用三色FISH分析17、X、Y染色体,并与G显带核型分析结果进行统计学比较。结果：PB探针的细胞信号率为98.7%(512/519)；混合探针1的混合探针1的细胞信号率为99.0%(502/507)；混合探针2的细胞信号率为98.6%。3例患者的外周血FISH结果与G显带核型分析结果相比,嵌合体比例均无统计学差异(P=0.868,0.755,0.644),但FISH诊断发现病例1存在小比例的47,XYY细胞系。第二部分FISH在性染色体非整倍体患者精液标本中的检测目的：探讨嵌合型克氏征患者(XY/XXY)及超雄综合征患者(XYY)精子中的非整倍体率,评估其子代遗传风险；比较克氏征嵌合型和超雄综合征患者未经优化处理及经密度梯度离心法、上游法处理后的精子非整倍体率,为其在IVF/ICSI治疗中选择精液处理方法提供依据。方法：3例XY/XXY患者、2例XYY患者及1例对照者手淫法取精,待液化后将每份患者精液标本分成3份,分别用离心浓缩、密度梯度离心及上游法处理,制片固定,并进行三色FISH杂交对精子17、X、Y染色体进行分析。将每例患者精子离心浓缩处理后FISH结果与对照者进行统计学比较；比较XY/XXY患者精子经三种方法处理后的非整倍体率；比较XYY患者精子经三种方法处理后的非整倍体率。结果：与对照组相比,三例嵌合型克氏征患者的X：Y与对照组相比差异均无统计学意义(P值均>0.05),精子染色体异常率增高、XY精子比例增高,病例1差异无统计学意义(P>0.05)；病例2、3差异有统计学意义(P值均<0.05)；两例超雄综合征患者的X：Y与对照组相比差异均无统计学意义(P值均>0.05),总精子异常率、YY精子及XY精子比例增高,病例4的XY精子与精子异常率增高明显(P值均<0.05),病例5的YY精子与精子异常率增高明显(P值均<0.05)。精液处理前及分别经两种优选方法处理后,精子染色体异常率无统计学差异(P>0.05)。第三部分FISH在植入前胚胎非整倍体筛查中的应用目的：建立用11种不同的染色体探针(1,7,13,15,16,17,18,21,22,X,Y号染色体探针)进行三轮FISH杂交检测单卵裂球的技术,同时探讨第3天胚胎中的嵌合体现象。方法：收集IVF/ICSI治疗周期中,受精后第3天的废弃新鲜胚胎44枚,及捐赠的冷冻胚胎16枚。蛋白酶消化透明带,从32枚废弃新鲜胚胎和12枚捐赠冷冻胚胎中吸取单卵裂球,剩余16枚胚胎中吸取≥2个卵裂球,用0.2%Tween-20/0.01N HCl+甲醇/冰醋酸(3：1)法固定,用11种染色体探针分三轮杂交对固定的细胞核进行FISH分析。结果：共获112个卵裂球,成功固定核108个,成功率为96.4%；FISH杂交后,103个核信号完整,杂交成功率为95.4%；分析单卵裂球的44枚胚胎中,应用5条、8条、11条探针的胚胎异常检出率分别为29.5%、54.5%和65.9；应用11条探针检测胚胎的正常率为34.1%,其中捐赠冷冻胚胎的正常率为41.7%,废弃新鲜胚胎的正常率为31.3%,两者相比无统计学差异(P>0.05)。分析≥2个卵裂球的16枚胚胎中7个为嵌合型,嵌合体率为43.8%,且都为二倍体嵌合型。结论：1.克氏征嵌合型患者及超雄综合征患者精子多数为整倍体精子,且X与Y精子数量相近,精子非整倍体率轻度增高,主要为XY精子增多。2.梯度离心法和上游法均不能降低克氏征嵌合型和超雄综合征患者精子中的非整倍体率。3.建立了应用11色探针进行三轮FISH杂交诊断单卵裂球的实验技术。4.在PGS诊断中,使用8条染色体探针(在5条基础上,增加15、16、22号染色体探针)较使用5条探针(13、18、21、X、Y染色体探针)明显提高胚胎异常检出率,使用11条探针(在8条基础上,增加1、7、17号染色体探针)可进一步提高异常胚胎的检出率。5.以形态学为标准的优质胚胎仍具有较高的染色体非整倍体率,以形态学指标为胚胎选择标准具有局限性。6.嵌合体现象在第3天胚胎中广泛存在,且以二倍体嵌合型为主。