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黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)是广泛分布于我国北方地区的小型啮齿动物,其繁殖力强,具有春季和秋季两个繁殖高峰期,是典型的季节性繁殖动物。哺乳动物的季节性繁殖活动受光周期调控,褪黑激素的分泌和GnRH合成释放是光周期调控动物季节性繁殖活动的主要因素,PT-TSH-TSHR-Dio2/Dio3-TH-GnRH通路在褪黑激素(MEL)介导光周期调控动物的季节性繁殖活动中发挥着重要的作用,但光周期调控TSH-Dio2/Dio3-TH系统表达的机制及效应还未见报道。本研究首先克隆得到黑线仓鼠TSHB启动子区序列1772 bp(MH005827);TSHR启动子区序列2054 bp(MH005826);Dio2 1479 bp(MH005824);Dio3 1550 bp(MH005825);TH 974 bp(MH005828)。经生物信息学分析,鉴定核心启动子区并成功预测CpG岛,根据分析结果,预测得到后续CpG岛基因甲基化分析序列:TSHB基因序列299 bp,包含4处CpG位点;TSHR基因序列233 bp,包含12处CpG位点;Dio2基因序列216 bp,包含11处CpG位点;Dio3基因序列159 bp,包含11处CpG位点;TH基因序列216 bp,包含11处CpG位点。随后,选取高繁殖季节(秋季)以及低繁殖季节(冬季)雌雄黑线仓鼠为动物材料,取其下丘脑提取基因组DNA,采用亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite Genomic Sequence,BSP),检测TSHB、TSHR、Dio2、Dio3、TH基因启动子的甲基化状态,利用Biq Analyzer2.0以及QUMA分析启动子甲基化结果,得到甲基化点状图,分别统计分析了不同基因、不同季节,不同性别间基因的甲基化水平差异,并探究了基因甲基化与相对表达的相关性。研究结果表明:(1)各基因的甲基化水平存在差异,其中TSHB与Dio2基因启动子呈高甲基化状态(80%左右),TSHR、Dio3基因启动子呈低甲基化状态(10%左右),而TH基因启动子,则呈中度甲基化状态(50%左右)。结果提示TSH-Dio2/Dio3-TH系统通过各基因不同程度甲基化参与基因表达调控进而影响繁殖活动,并且通过比较分析各基因启动子区序列结构,发现基因的甲基化水平可能与基因启动子的序列结构特征及CpG岛在启动子中所处位置有关。(2)将高繁殖季节与低繁殖季节黑线仓鼠下丘脑TSHB启动子甲基化率和TSHB mRNA相对表达量进行相关性分析后发现:相关系数r=-0.649,P=0.022,进一步说明了TSHB mRNA的表达量和TSHB启动子甲基化水平存在显著性负相关(P<0.05)。同样的,对TSHR、Dio2、Dio3 mRNA表达量与对应启动子甲基化率进行相关性分析,发现均呈负相关,其相关系数分别为-0.912(P=0.000)、-0.583(P=0.047)以及-0.849(P=0.000),由此我们可以推测出,启动子甲基化水平调控基因转录表达,启动子高度甲基化会降低基因转录表达水平,从而参与影响黑线仓鼠的季节性繁殖活动。(3)各基因在不同季节间表达的差异水平不一致:在高、低繁殖季节间Dio2启动子甲基化水平存在显著性差异(P=0.03),另外对TSHR分析显示不同季节间甲基化水平存在极显著性差异(P<0.001),然而对于Dio3、TSHB以及TH启动子甲基化状况进一步分析研究后发现不同季节间甲基化率均无显著性差异(P>0.05),提示黑线仓鼠季节性繁殖可能与TSHDio2/Dio3-TH系统基因启动子甲基化尤其是Dio2以及TSHR的甲基化的季节性变化相关。(4)Dio3启动子区的甲基化水平在性别间存在显著差异(P=0.012,P<0.05),其中雄性个体甲基化水平显著高于雌性,提示可能与黑线仓鼠的繁殖活动相关;而不同性别间,Dio2启动子甲基化水平不存在显著差异(P=0.226),另外,不同性别间TSHB、TSHR以及TH启动子甲基化水平也不存在显著性差异(P<0.05)。另外对黑线仓鼠下丘脑的Dio2、Dio3、TSHB、TSHR以及TH启动子甲基化水平进行季节以及性别交互作用分析发现:五个基因中仅在Dio3启动子甲基化分析中发现交互作用影响。综上所述,本研究以黑线仓鼠为研究对象,通过自然季节取样和亚硫酸盐测序法(BSP),首次探讨TSH-Dio2/Dio3-TH系统启动子区高繁殖季节与低繁殖季节甲基化在其繁殖活动的作用机制,从表观遗传学的角度揭示TSH-Dio2/Dio3-TH系统启动子区的甲基化存在季节差异并参与调控表达,为进一步深入研究哺乳动物季节性繁殖节律的调控机制提供新的思路和新的实验依据。