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目的:以毛菊苣(Cichorium glandulosum Boiss.et Hout)根为研究对象,采用药效追踪方式分离抗肝纤维化有效部位及成分,通过体内外活性跟踪探讨了倍半萜和总黄酮(Total flavonoids from root of Cichorium glanudulosum,TFCG)抗肝纤维化作用机制。方法:采用柱层析、制备液相等方法提取分离单体成分,应用2D-NMR技术对化合物进行鉴定。首先考察了 95%乙醇提取物(CG-I)对刀豆蛋白(Con A)诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用。昆明种小鼠60只,小鼠灌胃CG-I,阳性药甘利欣,对照组和模型组灌胃生理盐水。1天/次,连续十天。第十天灌胃结束后1小时尾静脉注射Con A(除正常组外)。检测各组小鼠血清指标、炎症因子、肝组织匀浆指标及HE染色。将CG-I萃取得到石油醚(CG-V)、乙酸乙酯(CG-Ⅵ)和正丁醇(CG-Ⅶ)萃取物灌胃硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)诱导的大鼠肝纤维模型。Wistar 大鼠 60 只,雌雄对半,分为 6 组,CG-V(15mg·kg-1),CG-Ⅵ mg·kg-1),CG-Ⅶ(6mg·kg-1),水飞蓟宾胶囊(8mg·kg-1)。除正常组外,其余各组以l00mg·kg-1腹腔注射TAA,2次/周。造模第5周始,正常组、模型组给予蒸馏水,其它各组动物灌胃给药,1次/天,连续8周,共12周。考察肝脏、脾脏系数、血清指标、病理检查、蛋白表达及肝组织细胞凋亡情况。将分离的3个倍半萜内酯类化合物,采用MTT和RT-PCR法考察24/48h其对TGF-β1刺激HSC-T6增殖的抑制作用及基因表达的影响。分离和纯化TFCG并考查了 TFCG对大鼠肝纤维化的作用机制,SD大鼠60只,除对照组外,其它各组大鼠首次皮下注射40%CC14-植物油混悬液1ml·kg-1,以后每次注射量为0.5ml·kg-1,对照组大鼠注射等体积生理盐水,2次/周。于第四周末把给药组大鼠随机分组为模型组、阳性药(水飞蓟宾)、TFCG高剂量(200mg·kg-1)、中剂量(1OOmg·kg-1)、低剂量(50mg·kg-1)。于第五周始给药组大鼠灌胃,共计13周。检测体内肝脾系数、血清指标、病理切片、免疫组化和蛋白表达等。RT-PCR方法考察24/48h其对TGF-β1刺激HSC-T6增殖的抑制作用及基因表达的影响。初步探讨人正常肝细胞株L02中PERK基因慢病毒修饰对内质网应激介导凋亡的作用。结果:鉴定了 3个倍半萜内酯类成分:11β,13-Dihydrolacurin、奥菊素和8-去乙酰母菊素-8-O-硫酸盐,其中1个为新化合物,1个为新天然产物,另1个为首次从毛菊苣根中分离得到,还有β-谷甾醇。CG-I对免疫性肝损伤小鼠保护作用,与模型组比较,CG-I给药组ALT、AST、GST和AKP水平均显著降低(P<0.05或P<0.01),肝脏、脾脏系数均显著下降(P<0.05或P<0.01);CG-I高剂量组IFN-γ显著下降(P<0.05),TNF-α、IL-1β水平均显著下降,T-SOD水平显著上升,MDA水平均显著降低,白蛋白水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。HE染色显示:CG-I各给药组肝损伤程度减轻。三个萃取物对TAA诱导的肝纤维化大鼠结果,与模型组相比,CG-Ⅶ组可降低肝脾脏系数(P<0.05);CG-Ⅵ可降低脾系数(P<0.01),给药组大鼠血清中AST和ALT活性显著降低(P<0.05,P<0.01);HE、Masson染色检测,治疗组(CG-V,CG-Ⅶ)的肝脏纤维化程度较模型组明显减轻。免疫组化显示,较模型组比较,CG-V与CG-Ⅶ显著降低了 FN、Smard3及TGF-β1表达(P<0.05),CG-Ⅴ与CG-Ⅶ与模型组比较凋亡指数显著降低(P<0.01);Western-Blot结果,CG-Ⅴ与CG-Ⅶ组FN和Smard3表达较模型组显著下降(P<0.05),IGFBPrP1表达CG-Ⅶ较模型组显著下降(P<0.05)。3个化合物对HSC-T6基因表达结果,药物对Smad2、Smad3、PPP5C和TGF-β1基因表达的抑制作用显著,24小时三个药物均具有极显著的抑制作用(P<0.01),但48小时抑制作用不显著;48小时三个药物均能显著上调Smad7基因表达(P<0.05或P<0.01),而24小时仅有奥菊素和8-去乙酰母菊素-8-0-硫酸盐个别浓度能够上调Smad7基因表达(P<0.05或P<0.01),Smad7基因表达时效关系成正比。TFCG的提取工艺条件为:80℃,用70%乙醇料液比1:15回流提取2小时,提取2次。AB-8纯化条件为:上样浓度3.Omg·mL-1,流速为4BV·h-1,5BV柱体积,吸附率达80%以上;50%乙醇洗脱,流速2 BV·h-1,2BV柱体积解吸率达90%以上。得到TFCG含量为50.82±0.37%(n=3)。TFCG对CC14诱导大鼠肝纤维化防治作用结果,与模型组相比,TFCG组、水飞蓟宾组肝脾脏系数均有所下降(P<0.05)。与模型组比较,各给药组大鼠血清ALT、AST、AKP、LDH水平均显著下降(P<0.05或P<0.01);TFCG高、低剂量组和水飞蓟宾组y-GT水平具有极显著性差异(P<0.01);TFCG和水飞蓟宾组大鼠血清Hyp水平有显著性差异(P<0.05或P<0.01);TFCG高、中剂量和阳性药白蛋白水平升高差异显著(P<0.05);TFCG高剂量组MDA水平降低差异极显著(P<0.01)。病理检查结果,TFCG各剂量组大鼠肝脏纤维有显著改善。免疫组化结果,TFCG各剂量组均能显著降低TGF-β1、Smad3、TLR4 和 α-SMA 蛋白表达(P<0.01 或P<0.05),显著上调 Smad7的表达(P<0.01)。蛋白质印迹法结果:与模型组比较,TFCG中、高剂量组和阳性药TGF-β1表达显著降低(P<0.05),Smad7表达明显增强(P<0.05)。RT-PCR结果:给药组对TGF-β1和PPP5CmRNA表达抑制作用24h优于48h作用,对Smad7基因的上调,48h的效果好于24h,Smad7基因表达时效关系成正比,而TGF-β1、PPP5C、Smad2和Smad3基因表达无明显的时效关系。TFCG中浓度组对于基因表达影响显著(P<0.01)。初步构建人蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)慢病毒载体并包装慢病毒颗粒,采用western-blot、流式细胞等技术考察L02细胞凋亡情况。结论:通过活性追踪探讨了倍半萜和TFCG抗肝纤维化作用机制,得到三个先导化合物。倍半萜类下调肝组织中FN、IGFBPrPl、Smad3与TGF-β 1的蛋白表达,抑制HSC-T6中 TGF-β1、Smad2、Smad3、PPP5CmRNA 表达以及上调 Smad7mRNA 表达,抑制HSC-T6的激活及增殖作用,有效阻断TGF-β/Smad信号转导通路。TFCG抑制肝组织中TGF-β1、Smad3、TLR4和α-SMA的表达,上调Smad7蛋白表达,对活化HSC-T6中TGF-β1、Smad2、Smad3、PPP5CmRNA表达具有显著的抑制作用,能极显著上调Smad7基因mRNA表达,有效阻断TGF-β/Smad信号转导通路,对α-SMA、TLR4和PPP5C蛋白及基因有显著的抑制作用。初步了解在内质网应激时,LV-PERK慢病毒可促进肝细胞株L02的增殖和凋亡作用。