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狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)引起的人兽共患传染病,几乎所有温血动物都对RV易感,因RV具有高度嗜神经性,其病死率高居各传染病之首,一旦发病几乎100%死亡,因而严重威胁着人类和动物的健康,至今尚未研究出有效的治疗狂犬病的方法。RV主要的储存宿主为野生动物,但是犬在携带和传播RV中起重要作用,是人畜感染狂犬病的最主要的来源。每年由犬狂犬病造成的人的死亡有55000多例,其中95%以上存在亚洲、非洲及拉丁美洲地区的发展中国家,且大多数死亡(84%)都发生在农村。所以动物特别是犬的狂犬病的预防在降低狂犬病的发生率上起到关键作用。目前国内预防狂犬病的发生主要使用灭活苗免疫动物,而糖蛋白(glycoprotein,GP)的量在很大程度上决定了灭活疫苗的有效性,GP是RV唯一的膜表面蛋白,参与病毒的吸附、传播,并与宿主细胞相互作用,诱导机体产生病毒中和抗体(VNA),并能刺激T细胞产生免疫,在病毒的致病和免疫中起着关键作用。GP还与病毒的神经嗜性有关,RV的主要特征是其神经侵入性,即病毒感染宿主后会以其独特的方式从外周神经通过神经节轴突运输侵入中枢神经系统(CNS)。同时GP也与RV的致病性相关。国内外已有实验室分别在基因组第一位、N-P位点、G-L位点插入G基因,构建出含有两个甚至三个G基因的重组狂犬病毒,并发现这些重组病毒与亲本病毒相比,均表现为致病力降低、GP在感染细胞中的表达量提高、免疫原性增强的趋势。但是在P-M位点插入额外GP基因对重组病毒致病力和免疫原性的影响,尚未有报道。为了研究RV增加G基因的重组表达对病毒致病力的影响,本研究利用负链RNA病毒反向遗传技术,构建了P、M基因之间额外插入G基因的重组狂犬病病毒Flury LEP株(rLEP-PGM)。并就重组病毒体外生长滴度、GP的表达水平及对小鼠的致病力等生物学特性,与亲本株LEP进行了比较研究。亲本株和重组病毒具有相似的生长特性,LEP和rLEP-PGM在BHK-21细胞的生长滴度分别为4×10~6 FFU/mL和2.5×10~6 FFU/mL,在小鼠神经母细胞(NA)的生长滴度分别为4×10~7 FFU/mL和2.5×10~7 FFU/mL,嗜神经指数均为1;Western blot分析显示,rLEP-PGM在感染细胞的GP表达量比LEP显著提高;小鼠感染试验显示,rLEP-PGM与LEP脑内注射小鼠的MLD50分别为3 FFU和1 FFU,肌肉注射途径的MLD50分别为4.6 LgFFU和5.5 Lg FFU。结果表明,P-M基因之间插入一个额外的G基因能够提高GP的表达水平,同时增强重组病毒外周侵入CNS的能力。