论文部分内容阅读
肝脏作为重要的代谢器官,广泛参与糖代谢,蛋白质代谢以及脂类代谢。肝脏同时也是一个重要的免疫器官,富含大量天然样免疫细胞以及获得样免疫细胞,其在自免疫性炎症,微生物感染以及肿瘤的免疫监视过程中发挥着重要的作用。由于肝脏具备天然免疫优势状态,同时富含大量的调节性细胞以及独特的结构特征,容易在肝脏引发全身耐受,因而肝脏又是一个重要的耐受器官。嗜肝病毒感染,如乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染肝脏后,容易诱发肝脏耐受,形成慢性HBV感染(Chronic Hepatitis B,CHB)。病毒特异性T细胞免疫应答以及体液免疫应答对于病毒的清除至关重要,但是在CHB患者肝脏以及外周血中,病毒特异性T细胞经常发生耗竭甚至克隆丢失,从而失去抗病毒能力,使得病毒抗原在肝脏中持续性表达。天然免疫系统对调节获得性免疫应答具有重要的调节能力,在病毒感染过程中,天然免疫应答的强弱以及持续时间对于病毒特异性T细胞免疫应答或者抗体产生息息相关,比如树突状细胞(dendritic cell,DC), macrophage等呈递抗原的能力,又比如NK细胞,Thl细胞产生IL-2促进CD8+T细胞存活和扩增等。在本文中我们着重研究了γδT细胞—一类重要的天然样免疫细胞—在HBV耐受过程中的作用,我们的结果表明其似乎更像是发挥着旁观者效用。慢性HBV感染与肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)的发生密切相关。我国目前每年约有30万人死于肝脏肿瘤,其中绝大部分为慢性HBV携带者。HBV感染肝细胞后,基因组发生的随机插入以及HBx蛋白的表达与肝细胞恶性化密切相关。同时HBV病理学进程表明,当肝脏中HBV病毒复制活跃,这时期可观察到显著的肝脏炎症,这类HBV携带者更容易发生肝细胞癌变,暗示肝脏慢性炎症对于HCC的发生密切相关,这也与目前广泛接受的慢炎诱癌学说不谋而合。因而研究HBV诱导的肝细胞癌为临床治疗提供了新的理论依据。本文将阐释在原发性肝脏肿瘤发生过程慢性炎症发挥着重要的作用。本文取得的主要结果从以下两个方面概述。I、γδT细胞调节肝脏免疫耐受的研究本研究采取pAAV/HBV1.2以及rAAV/HBV1.3病毒注射构建了HBV携带小鼠,WTHBV携带小鼠可检测到肝实质中病毒抗原的表达,并且分泌到胞外在血清中可以检测到高浓度的HBsAg, HBeAg, HBV-DNA等表达,同时肝脏几乎没有炎症,抗原特异性体液免疫应答以及T细胞免疫应答均受损；因而该模型模拟了人群中的慢性HBV携带者免疫耐受期的状态。首先我们检测到HBV耐受小鼠中γδT细胞的总数尤其是Vγ4细胞亚群发生了显著的上调。进一步我们采取TCRδ-/-小鼠观察到HBV耐受不能形成,血清中HBV抗原以及肝脏表达的HBc抗原明显下降直至消失。采用Anti-yδTCR清除HBV携带小鼠全身γδT细胞也获得了类似的结果；进一步我们分选出γδT细胞转输TCRδ-/-小鼠后,HBV耐受恢复,因此表明,γδT细胞对于HBV耐受的形成至关重要。接下来我们检测发现TCRδ-/-小鼠相比WT小鼠,肝脏HBV特异性体液免疫应答没有差异,调节性T细胞和Kupffer细胞比例也没有差异；非常有意思的是肝脏的HBV特异性CD8+T细胞比例以及功能均发生了显著的上升；表征CD8+T细胞的耗竭被逆转。进一步我们发现γδT细胞对于CD8+T细胞的耗竭发挥着旁观者效应。持续性表达的HBV抗原对于γδT细胞产生IL-17进而招募髓系来源抑制细胞(MDSC)进入肝脏至关重要.MDSC继而通过产生iNOS以及arginase-1直接抑制了CD8+T细胞的活化。在IL-17-/-小鼠中,我们也观察到MDSC显著减少,同时CD8+T细胞功能恢复,并且HBV耐受不能形成。体内抑制arginase-1亦显著改善CD8+T细胞功能并且加速HBV排斥。综上所述；γδT细胞作为一种天然样T细胞,在HBV耐受的形成过程中起始了MDSC的肝脏聚集,诱使CD8+T细胞发生功能耗竭而导致肝脏耐受。靶向这一过程能显著改善HBV特异性T细胞功能,促进HBV的排斥。Ⅱ、NK细胞抵抗CCl4诱导的肝细胞癌的研究本研究采取HBV转基因小鼠模型,由于该小鼠具备轻微自发炎症且自然发生肝脏肿瘤,很好的模拟了临床上HBV患者高发肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)的现象。为了验证慢性炎症诱发肿瘤,我们采取连续CCl4注射诱导肝脏持续性炎症,观察到在HBV转基因小鼠中约6个月即发生肝脏肿瘤,表明慢性炎症确实促进了肝脏肿瘤的发生。进一步我们发现CCl4诱导HBV转基因小鼠肝脏炎症的同时,伴随着肝脏上皮间质转化(EMT)的发生,EMT被认为是肿瘤生长以及迁移的重要机制。同时我们注意到肝脏NK细胞活化性分子下调,抑制性分子上调,表明NK细胞受到抑制。进一步我们观察到清除NK细胞后,肝脏EMT标志蛋白vimentin表达显著上调。清除NK细胞后可观察到慢性炎症诱导的肝脏肿瘤显著增多；表明NK在该过程中发挥着免疫监视功能。采取Ployl:C活化NK细胞,可显著减少CCl4诱导的肝脏肿瘤的发生。此外,我们慢炎诱癌的模型还可以用于肝脏肿瘤的治疗和预防研究。比如由于免疫细胞可能介导了肝脏炎症,因而采取了免疫抑制剂处理,观察到抑制免疫细胞后,肝脏肿瘤生长更快；而采取非甾体类抗炎药处理,我们观察到一定的抑癌效果。非常有意思的是,PolyI:C处理HBV转基因小鼠后可以显著预防肝脏肿瘤的发生。综上所述,我们构建了一个非常实用的慢性炎症诱导肝脏肿瘤模型,并且观察到NK细胞通过靶向抑制EMT发挥免疫监视功能。采用非甾体类抗炎药饲喂HBV转基因小鼠可以一定程度上抑制肝脏肿瘤生长。