论文部分内容阅读
研究背景和目的:骨质疏松症在老年人和绝经后妇女当中很常见,其主要原因是骨吸收率大于骨形成率而造成骨密度下降,导致骨折易发生。破骨细胞是唯一具有骨吸收作用的细胞,通过抑制其形成或功能是治疗骨质疏松症的有效方法。本课题通过利用基因芯片筛选破骨细胞不同时期的差异基因并运用信息生物学进行分析,进而寻找可能基因蛋白靶点,然后使用对应抑制剂验证其对破骨细胞作用,从而为骨质疏松治疗提供新药物选择。方法:1.通过GEO数据库下载包含有破骨细胞不同时期的两组基因芯片数据。利用R语言Limma包筛选出破骨细胞形成和分化过程中的差异表达基因。运用DAVID在线分析软件对差异基因进行基因本体功能注释和KEEG通路分析。并通过STRING在线分析软件构建基因蛋白互作网络。使用Cytoscape的MCODE插件最终选出核心分子模块,确定核心基因。2.通过C57B/L6小鼠获得骨髓巨噬细胞,用30 ng/mL M-CSF诱导其成破骨前体细胞。用不同剂量浓度NFκB抑制剂JSH-23对其进行干预,5天后通过MTS实验评估JSH-23对破骨前体细胞增殖影响。通过使用30ng/mL M-CSF、l00ng/mL RANKL诱导骨髓单核巨噬细胞分化为成熟破骨细胞。在RANKL诱导破骨细胞分化过程中,加入不同浓度JSH-23进行干预,5天后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色,最后通过显微镜观察破骨细胞大小及数量。BMMS细胞在羟基磷灰石板培养并加入RANKL诱导,同时加入不同浓度JSH-23,最后再显微镜下观察羟基磷灰石涂层的吸收面积并用ImageJ软件分析。在RANKL诱导破骨分化的过程中,加入不同浓度的JSH-23,5天后提取细胞RNA,转录成cDNA,最后通过实时荧光定量PCR测定对应mRNA表达情况。单独使用RANKL或同时使用RANKL和JSH-23对破骨前体细胞进行诱导1小时,分别提取不同时间点细胞总蛋白,然后通过蛋白印迹实验检测蛋白表达变化。结果:1.通过两组破骨细胞分化过程的基因芯片进行分析,破骨细胞分化早期筛选出上调基因30个,下调基因19个;在破骨细胞分化中期筛选出上调基因4个。并构建蛋白相互作用网络,并选出差异基因中2个关键分子网络,分别是Mmp9、Src、Plau、Vegfc、Met、Mmp14和Traf1、Nfkbie、Nfkb2、Fos、Ctsk、Acp5。2.NF-κB抑制剂JSH-23在10μM浓度下对破骨细胞前体细胞无毒性作用;JSH-23能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化及破骨细胞对羟基磷灰石溶解作用;JSH-23抑制RANKL诱导破骨细胞TRAP、CTSK、c-Fos和NFATc1基因mRNA表达量变化,并能抑制RANKL诱导破骨细胞分化过程中NFκB p65的蛋白磷酸化。结论:1.我们在破骨细胞分化两个时期中共筛查出53个差异基因,为进一步研究提供理论基础;2.NFκB抑制剂JSH-23能抑制破骨细胞分化及骨吸收作用,并能影响相关基因及蛋白表达。