目的：　　V-ATP酶（vacuolar ATPases）（或称囊泡型ATP酶），作为ATP依赖型的质子泵，广泛存在于真核细胞表面，是一种由多个亚基组成的膜蛋白复合物。H亚基连接V1和V0结构域，催化ATP水解，是V-ATP酶的一个小亚基。ATP6V1H是编码V-ATP酶V1结构域中H亚基的基因。本课题组前期研究证实ATP6V1H编码的囊泡型ATP酶（V-ATP酶）中的H亚基对破骨细胞的功能起到调节作用，同时Atp6v1h参与小鼠骨形成过程的调控，该基因部分功能缺失即会抑制骨形成。但此种抑制作用在小鼠生长过程中出现的时机，及此种抑制现象是否在骨髓基质细胞的水平就已出现变化，其机制尚不清楚。基于以上问题，本课题从骨骼生长的体内研究及骨髓基质细胞生长和分化的体外研究两方面入手，对ATP6V1H参与调控骨髓基质细胞（BMSCs）生长和分化的机制进行了探讨，以期为临床治疗提供新的分子靶点。　　方法：　　1、ATP6V1H在小鼠BMSCs中的表达：剪取鼠尾组织进行DNA提取，PCR后测序，鉴定基因型；全骨髓贴壁分离法分离提取小鼠BMSCs，传代培养，观察两种基因型细胞一般生长状态的差异。实时定量PCR检测Atp6v1h在Atp6v1h+/+及Atp6v1h+/-两种基因型BMSCs中表达的差异。Western blot及免疫组化染色检测两种基因型BMSCs中Atp6v1h蛋白水平的表达差异。　　2、ATP6V1H对小鼠BMSCs增殖能力的影响：CCK-8细胞增殖活力检测两种基因型BMSCs的增殖活力，流式细胞周期检测Atp6v1h+/+及Atp6v1h+/-BMSCs细胞周期。　　3、ATP6V1H对小鼠BMSCs分化能力的影响：通过使用成骨、成脂分化诱导液对BMSCs进行分化诱导，随后采用茜素红S染色、油红O染色和Q-PCR的方法，判定两种基因型BMSCs在钙结节形成能力和脂肪细胞形成数量的差异。通过检测成骨、成脂过程中的标志性基因的差异，验证Atp6v1h+/+、Atp6v1h+/-BMSCs成骨、成脂能力间存在的差异。　　4、ATP6V1H调控小鼠骨骼生长的体内研究：取2周龄、6周龄和3月龄野生型雄性小鼠的股骨，制备石蜡切片，进行改良丽春红三色法染色，观察不同年龄段小鼠股骨组织骨结构的变化。　　5、ATP6V1H影响小鼠BMSCs分化的机制探讨：本部分实验采用Q-PCR方法，对Atp6v1h+/+、Atp6v1h+/-BMSCs进行成骨、成脂诱导后TGF-β1及其受体的mRNA水平进行检测。同时，对能与ATP6V1H相互作用的TGF-β1结合蛋白Ap2b1、及其结合单位Ap2m1的mRNA水平进行了检测，探讨ATP6V1H通过TGF-β1下游通路调控BMSCs分化的机制。　　结果：　　1、野生型及杂合型Atp6v1h基因敲除小鼠在生长发育、外形及繁育能力上，并未表现出明显的差异。鼠尾基因型的鉴定结果显示杂合子小鼠缺失了一个5bp（CGAGG）的碱基，且存在一个造成翻译过程提前终止的（T＞G）碱基置换。ATP6V1H在BMSCs中有表达。在Atp6v1h+/-BMSCs中，ATP6V1H蛋白水平和基因水平的表达量均较野生型低。　　2、原代培养Atp6v1h+/+及Atp6v1h+/-BMSCs，发现两种细胞初始阶段在细胞形态及贴壁时间上无显著差异。Atp6v1h+/-BMSCs在接种后的第24小时开始，出现增殖速度低于野生型（P＜0.05）。和野生型相比，Atp6v1h+/-BMSCs中处于S期和G2期的细胞比例降低，而处于G1期的细胞量增多，差异具有显著性（P＜0.05），因此，和野生型相比，Atp6v1h+/-BMSCs表现为细胞增殖速度减慢，细胞周期阻滞。　　3、成骨、成脂分化诱导Atp6v1h+/+及Atp6v1h+/-BMSCs，Atp6v1h+/-BMSCs的钙结节形成能力减弱而脂肪细胞形成能力增强。成骨、成脂相关基因mRNA水平的检测结果也证实了这一现象（P＜0.05）。因此，Atp6v1h+/-BMSCs表现为成骨能力减弱而成脂能力增强。　　4、通过对不同年龄段小鼠股骨组织切片染色观察其骨结构的变化，结果显示，和野生型相比，2周龄Atp6v1h+/-小鼠股骨的生长板厚度和形态并未表现出显著差异，6周龄组，杂合型小鼠骨小梁体积与数量减少，生长板的厚度降低，并呈现出软骨发育不良的表现。此种差异在3月龄组中表现更为明显。因此，组织切片染色结果证实了随着年龄的增长，Atp6v1h+/-小鼠骨质出现骨形成减弱，脂肪变性现象增多。　　5、在未经分化诱导的两种基因型BMSCs中，Tgfb1，Tgfbr1和Tgfbr2在Atp6v1h+/-BMSCs中的表达量均低于野生型。Atp6v1h+/-BMSCs在成脂诱导后，Tgfb1的表达量明显高于其他组。经过成骨、成脂诱导后，野生型BMSCs Tgfbr1的表达量无显著变化，虽然在成脂诱导后呈现下降趋势，但此种差异无统计学意义。在杂合型BMSCs组中，Tgfbr2在成脂诱导后增加，而Tgfbr1在成骨诱导后的表达增加更为明显。和野生型BMSCs相比，Ap2m1和Ap2b1在Atp6v1h+/-BMSCs诱导前的mRNA水平较弱，成骨和成脂诱导后表达增加，与Atp6v1h+/-BMSCs中Tgfb1和Tgfbr1的表达相似。　　结论：　　1、ATP6V1H调节BMSCs增殖和分化。　　2、ATP6V1H的缺乏降低BMSCs的增殖能力，同时也干扰BMSCs的成骨分化能力，而促进脂肪细胞形成，致使杂合小鼠的BMSCs发生骨形成受抑制，并在成年小鼠的骨髓中出现脂肪细胞的数量增多现象，其机制可能与ATP6V1H、TGF-β受体I和AP-2复合物之间的相互作用有关。