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目的建立一种肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）定植在鼻腔后，以不可分型流感嗜血杆菌（Nontypeable haemophilus influenzae,NTHi）二次感染，接种至小鼠鼓室内引起急性中耳炎（Acute OtisisMedia, AOM）模型的实验方法。并以此为对象对二次感染机制进行研究。方法1.选择健康SPF级C57BL/6J小鼠，用注射器刺穿鼓膜向鼓室中接种106、107、108CFU/耳三种浓度的NTHi作为实验组，以向鼓室中注射PBS的小鼠为对照组。建模后每日称重并观测小鼠日常行为及状态。建模后1、3、5、7天时，各组分别处死，采集血清及中耳灌洗液上清用ELISA检测细胞因子，取中耳灌洗液中细胞进行流式细胞术观察，取听泡固定并脱钙，进行石蜡切片并作HE染色。从各方面判定急性中耳炎模型是否建立成功。2.先以S.pn19F给C57BL/6J小鼠滴鼻，以便S.pn在鼻腔定植，然后再经鼓膜穿刺注入NTHi，建立二次感染中耳炎模型，观察小鼠日常行为及称重，取心脏血和中耳灌洗液进行细菌培养，计数中耳灌洗液中细胞数量，并检测中耳灌洗液上清和血清中的细胞因子含量变化。结果1.体重：PBS组Day1有少许下降，之后稳步上升，而NTHi组则Day1、Day2体重下降之后延迟到Day3体重才开始恢复。细胞计数中可见炎性细胞浸润主要以中性粒细胞为主，可达99%，但PBS组中细胞总数远远小于NTHi各组。中耳组织切片可以见到脓性物渗出，大量炎症细胞浸润，偶见中耳骨结构遭破坏，血清及中耳灌洗液中细胞因子：中耳灌洗液上清中IL-6和TNFα升高，而血清中各细胞因子无变化。2.体重：coIF组小鼠在滴鼻后，体重有所下降，但在于NTHi同时接受鼓膜穿刺后，体重下降水平相同，无统计学差异。细菌清除能力：coIF组小鼠与NTHi组小鼠中耳腔中细菌清除能力无差异。细胞计数：coIF组中耳腔中的炎性细胞募集增多。细胞因子：同时IL-1β及TNF-α的表达均高于NTHi组。结论本研究成功建立了NTHi致急性中耳炎模型以及S.pn与NTHi二次感染致急性中耳炎模型，并对该模型中耳微环境中的炎症细胞和炎症因子进行了检测，为后续研究微生物与微生物、多种微生物与宿主之间的相互影响打下了基础。