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牛病毒性腹泻/粘膜病(Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD),简称牛病毒性腹泻(BVD)或牛粘膜病(BMD),是由黄病毒科、瘟病毒属(Flaviviridae Pestivirus)的牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(BVD/MDV)感染牛引起的以发热、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽、持续性感染与免疫耐受及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病。该病呈世界范围分布,严重危害养牛业的发展。国内外报道的检测、诊断BVDV 的方法很多,但主要有抗体诊断方法和抗原诊断方法,以诊断抗原为主,并且这两大类诊断方法经常联合应用取得很好的效果。本研究就是从诊断抗原入手,建立BVDV RT-PCR 检测和分型方法,为BVD 的快速检测奠定了基础。BVDV 虽只有一种血清型,但根据5’非翻译区序列的不同划分为两种基因型,BVDVⅠ和BVDVⅡ;同时,根据能否引起细胞病变,可将BVDV 分为二种生物型即CP 和NCP。根据GenBank中已发表BVDV基因组序列,兼顾BVDV不同血清型的序列差异以及与HCV 和BDV序列间的差异,BVDV 5’-UTR序列在各毒株间保守程度很高,BVDVⅠ和BVDVⅡ序列的不同也主要表现在这里,所以选择在BVDV的5’-UTR设计BVDV特异性引物和区分基因型引物;BVDV生物型的转换主要涉及到是否有外源RNA的插入,所以鉴定生物型引物选择在RNA插入位点两端的保守区。利用RT-PCR方法,利用Trizol试剂盒提取病毒基因组RNA,反转录后,经过94℃预变性5min,30个循环(94℃变性50s,56℃退火50s,72℃延伸1min),72℃终延伸7min,4℃终止反应,克隆得到目的片段,并进行测序,分析比较同源性,结果均与预期相符。利用Reed-Muench方法测得BVDV细胞培养毒的TCID50,十倍梯度稀释后,分别提取RNA,进行PCR扩增,试验结果表明可以检测到1个TCID50。选取临床症状相似的口蹄疫病毒、牛鼻气管炎病毒、水泡性口炎病毒,及有血清学交叉反应的猪瘟病毒,分别提取RNA(DNA),进行PCR扩增,结果三对引物只能以BVDV的RNA反转录的cDNA为模板,扩增出与各自实验设计相符目的片段,而对照毒株的扩增结果均为阴性。结果表明RT-PCR检测方法有很好的特异性。将病毒接种于健康犊牛体内,间隔三天采集全血、鼻液和粪便,利用RT-PCR可以在其全血及感染早期鼻液中检测到BVDV阳性。以上结果表明本研究建立的RT-PCR检测方法,不仅可以准确快速诊断BVD,而且利用不同的引物可以区分BVDV的基因型和生物型。从而为本病的诊断及分型奠定了基础。