杜氏盐藻(Dunaliella salina)cDNA文库构建及表达序列标签分析

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杜氏盐藻(Dunaliella salina),属于绿藻门,绿藻纲,团藻目。是一种单细胞绿藻,无细胞壁,能在0.5~5.5 mol/L NaCl的盐浓度中生存。被认为是唯一能在高盐浓度范围生长,并能进行光合自养的真核生物。由于是最耐盐的真核生物,且拥有简单的细胞结构,因此成为研究耐盐机制和寻找耐盐基因的理想模式生物。近年来,杜氏盐藻也成为固定大气中CO2,减少温室效应,并产生生物能源的研究热点。   然而,杜氏盐藻的基因组信息尚未测序完成,关于杜氏盐藻的基因信息非常少,在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上,杜氏盐藻的核苷酸序列只有213条,表达序列标签(EST,Expressed Sequence Tag)仅有3936条。而这些有限的基因信息,对于进一步研究杜氏盐藻是远远不够的。因此,构建一个高质量的杜氏盐藻的cDNA文库,为快速、方便的筛选和分析杜氏盐藻中的有价值的基因提供了平台,为构建遗传图谱和比较基因组学提供了依据。   我们在室内成功养殖杜氏盐藻(Dunaliella salina)的基础上,绘制了杜氏盐藻在1.5 mol/L NaCl 盐浓度下的生长曲线。使用宝生物cDNA 文库构建试剂盒,构建在1.5 mol/L NaCl盐胁迫下的杜氏盐藻的cDNA 文库。取处于生长对数期的杜氏盐藻,提取总RNA和mRNA后,利用反转录酶M-MLV 合成cDNA 第一条链,再将RNA 链置换成DNA 链,合成cDNA 第二条链,加上EcoR I 接头,Not I酶切后,经过Spin Column除去短链cDNA,与载体pAP3neo 进行连接,转化大肠杆菌DH10B。经鉴定,原始文库的滴度达1.2×106 cfu/mL,重组率高达95%,且多数插入片段均在500bp 以上。随机挑取70个单克隆进行序列测定,得到66条非冗余序列。所测序列经过生物信息学方法分析后,除13个ESTs(Expressed Sequence Tags,表达序列标签)与NCBI Genbank中的已知盐藻EST 高度同源外,其它EST 均为新的未见报道过的表达序列标签,这些新的ESTs数据,很有可能编码杜氏盐藻中的独特基因,为进一步筛选和克隆杜氏盐藻耐盐性基因提供了筛选平台,为盐藻基因组以及EST数据库增补了大量信息。
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