第一部分：卡维地洛对早期糖尿病大鼠过氧化应激状态及心脏重构的影响及机制研究背景和目的： 糖尿病患者心脏病因死亡占死因首位约为三分之二，主要死因为心力衰竭。糖尿病心力衰竭进展快，病死率高，因其更具有隐蔽性而诊断困难，故我们认为理想的治疗应当是在早期阻断其向心力衰竭发展的路径。糖尿病心脏损害较早期就已经存在神经内分泌系统的过度激活、过氧化应激、细胞外基质增生、心肌肥厚纤维化等等，所有这些因素综合作用促使心脏重构及功能障碍，但是早期临床上可以无任何症状。卡维地洛，非选择性的β受体阻滞剂，选择性的α1受体阻滞剂，除了能够阻断神经内分泌系统激活以外，近年来许多研究还发现其有抗氧化、抗增殖、抗凋亡、抗炎症等功能，而且治疗剂量时其对血糖、血脂没有不良影响。故我们从理论上推测其可能对糖尿病较早期心肌损害产生有利影响。本研究旨在观察卡维地洛是否能从抗氧化途径及阻断心脏重构途径对糖尿病大鼠早期心脏损害产生保护作用，并探讨其机制。 方法： 1.制备糖尿病模型及卡维地洛灌胃治疗。SD大鼠空腹链脲佐菌素60mg/kg一次性腹腔注射制模，72小时后微量法随机测血糖＞16.7mol/l入组。卡维地洛配置成生理盐水溶液，分别以1mg/kg，10mg/kg灌胃治疗。大体动物分6组：正常对照生理盐水灌胃组(C，n=9)；正常对照组1mg/kg/d卡维地洛灌胃组(CS，n=8)；正常对照组10mg/kg/d卡维地洛灌胃组(CL，n=9)；糖尿病生理盐水灌胃组(D，n=9)；糖尿病1mg/kg/d卡维地洛灌胃组(DS，n=9)；糖尿病10mg/kg/d卡维地洛灌胃组(DL，n=9)。 2.心脏超声及血液动力学指标检测。超声指标：左室舒张末期内径(LVDd)、收缩末期内径(LVDs)、左室后壁厚度(LVPWT)、室间隔厚度(IVST)、射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)。血液动力学指标：左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、心率(HR)、最大收缩/舒张速率。 3.心室/体重比。沿房室沟剪去心房及结缔组织，计算心室重/体重比值。 4.心肌组织处置及血生化指标检测。心尖处三分之一心室肌液氮冻存，中间三分之一福尔马林固定，心底三分之一组织匀浆采用谷胱苷肽与二硫代二硝基苯甲酸显色反应测定谷胱苷肽过氧化物水平，黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶反应检测超氧化物歧化酶活性，过氧化氢显色紫外分光法检测过氧化氢酶活性，采用硫代巴比妥酸反应产物显色检测脂质过氧化物标志物丙二醛水平。从颈动脉取血后，离心，分离上清液采用胆固醇氧化酶—过氧化物法检测总胆固醇。 5.病理染色及结果判断。石蜡包埋后，分别进行HE染色、MASSON胶原染色。观察心肌形态、胶原分布，冠脉血管内狭窄情况，分别计算心肌组织胶原容积积分及心肌血管周围胶原面积。 6.半定量RT-PCR检测BCL-2、TGF-β1mRNA的表达。引物由PRIMER3设计，上海生工合成，采用一步法RT-PCR，GAPDH为内参照。电泳后图像分析，灰度扫描半定量各基因mRNA表达量。 结果： 1.第5周末糖尿病大鼠体重较正常对照组显著减轻(167±12vs.363±56，P＜0.01)，血糖显著升高(20.59±2.62vs.4.94±0.48，P＜0.01)，血浆总胆固醇明显增加(5.17±1.03vs.2.03±0.39，P＜0.01)。卡维地洛的治疗显著增加糖尿病生理盐水组体重，未改变血糖、血浆胆固醇水平。 2.第5周末糖尿病大鼠心室重/体重比值显著增高，增加为正常对照的1.4倍。小剂量卡维地洛治疗使糖尿病大鼠心脏重/体重比趋于正常对照水平(P＞0.05)，大剂量卡维地洛进一步减小了心脏重/体重比。提示第5周末糖尿病大鼠心脏发生肥厚，卡维地洛抑制了这种改变。 3.心脏超声显示糖尿病组与正常对照组相比，左室射血分数、左室短轴缩短率、室间隔增厚率、左室后壁增厚率等收缩功能指标均显著降低(P＜0.05)，而左室舒张末期内径较正常对照组减小。卡维地洛灌胃治疗后，左室收缩末期内径显著缩小，左室射血分数，左室短轴缩短率显著提高。心室内血流动力学显示：糖尿病组心率显著低于正常对照组(P＜0.05)，糖尿病组左室发展压、收缩及舒张时间变化率均显著降低，而左室舒张末压显著抬高。小剂量及大剂量卡维地洛治疗使糖尿病大鼠收缩及舒张时间变化率均显著抬高，其中大剂量组还降低左室舒张末压及糖尿病大鼠的心率。提示第5周末糖尿病大鼠心功能减低，卡维地洛改善了糖尿病大鼠心脏收缩及舒张功能。 4.卡维地洛降低正常对照组丙二醛水平。糖尿病组丙二醛、过氧化氢酶水平升高，超氧化物歧化酶、谷胱苷肽过氧化物水平显著降低。卡维地洛治疗使糖尿病大鼠心肌丙二醛水平减低，增加过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱苷肽过氧化物水平，并呈现剂量相关性。提示第5周末糖尿病心肌存在氧化—抗氧化系统紊乱，卡维地洛则提高了糖尿病抗氧化应激能力。 5.HE染色及MASSON染色显示：糖尿病心肌细胞排列紊乱，胶原纤维增生，冠脉管壁胶原纤维增厚，管腔内未见狭窄及粥样斑块，心肌组织胶原容积积分及心肌血管周围胶原面积显著提高。卡维地洛治疗显著降低糖尿病组心肌组织胶原容积积分及心肌血管周围胶原面积，对正常对照组无明显影响。提示第5周末糖尿病心肌存在胶原纤维增生、心脏重构，卡维地洛的治疗抑制了心脏重构。 6.半定量RT-PCR显示：糖尿病组BCL-2mRNA表达显著减低，而TGF-β1mRNA表达显著增高。而卡维地洛的5周治疗显著增加BCL-2mRNA表达，降低TGF-β1表达，卡维地洛增加了正常对照组BCL-2mRNA表达，这种作用均呈现剂量相关性。提示卡维地洛在基因转录水平抑制心脏重构。 第二部分：卡维地洛对糖尿病线粒体通透性转换的影响及机制研究研究背景和目的： 线粒体通透性转换孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP)是位于线粒体内膜的通道复合体，在缺血后的再灌注损伤早期开放，可以诱发细胞凋亡或坏死，被学者们称为细胞生命的主宰。超过生理浓度的钙离子是MPTP最重要的促开放剂，近年研究发现，过氧化应激能够显著增加MPTP对钙离子的敏感性，促进开放，增加细胞凋亡和坏死。过氧化应激在糖尿病病理生理进程中扮演重要角色，包括改变线粒体的功能。卡维地洛在正常心肌细胞可以通过减少过氧化应激减轻MPT发生，然而，卡维地洛能否在糖尿病心肌细胞也产生类似的效果，目前国内外尚无报道。本研究旨在观察卡维地洛是否能减低糖尿病心肌线粒体MPTP对钙离子的敏感性，从而产生线粒体保护作用。 方法： 1.制备糖尿病模型及卡维地洛灌胃治疗。SD大鼠空腹链脲佐菌素60mg/kg一次性腹腔注射制模，72小时后微量法随机测血糖≥16.7mol/l入组。卡维地洛配置成生理盐水溶液，分别以1mg/kg，10mg/kg灌胃治疗。大体动物分四组：正常对照生理盐水灌胃组(C)；糖尿病生理盐水灌胃组(D)；糖尿病1mg/kg卡维地洛灌胃组(DS)；糖尿病10mg/kg卡维地洛灌胃组(DL)。 2.线粒体分离及分组。第5周末大鼠被断头处死后，开胸取心脏，制备心肌组织匀浆，密度梯度离心法分离线粒体。 线粒体吸光度测定时各组大鼠心肌线粒体再分为两组： ①直接加入200μmol/lCa2+组； ②先加入1μmol/l环孢菌素A孵育1分钟后，再加入200μmol/lCa2+组。 线粒体细胞色素c及活性氧检测各组大鼠心肌线粒体再分为三组： ①直接加入200μmol/lCa2+组； ②先加入1μmol/l环孢菌素A孵育1分钟后，再加入200μmol/lCa2+组。 ③先加入1μmol/l过氧化氢酶孵育1分钟后，再加入200μmol/lCa2+组。 3.分光光度法测定钙离子诱导下线粒体发生肿胀后的吸光度变化，吸光度540nm。 4.高效液相法检测钙离子诱导下线粒体通透性转换孔开放后所释放的细胞色素c浓度。 5.荧光分光光度法半定量测定钙离子诱导下线粒体活性氧的产生。采用对活性氧敏感的2,7-二氯氢化荧光素二乙酯标记钙离子诱导下产生的活性氧，进行半定量。荧光分光光度剂在钙离子加入后持续测量10分钟。发射波长475nm，接受波长525nm。 结果： 1.糖尿病大鼠心肌线粒体与正常对照组相比，在钙离子诱导后十分钟时吸光度的减低更少，提示钙离子诱导下线粒体发生的肿胀程度或肿胀的数量更少，线粒体通透性转换孔(MPTP)的特异性抑制剂环孢菌素A的应用几乎完全阻止了吸光度的减少，说明线粒体肿胀与MPTP开放有密切关系。提示糖尿病大鼠线粒体通透性转换孔对钙离子敏感性减低。卡维地洛治疗组在钙离子诱导后十分钟时吸光度的减低与糖尿病组无显著性差异。 2.糖尿病大鼠心肌线粒体与正常对照组相比，在钙离子诱导后十分钟释放的线粒体内膜标志酶——细胞色素c更少，而MPTP特异性抑制剂环孢菌素A的应用几乎完全阻止细胞色素c释放，说明细胞色素c的释放与MPTP开放有密切关系。结果提示钙离子诱导下线粒体通透性转换孔对钙离子敏感性减低。大剂量卡维地洛治疗组在钙离子诱导后十分钟细胞色素c的释放显著低于糖尿病组，提示卡维地洛可能减少了MPTP的开放。