随着中国老龄化日益严重,缓慢性心律失常(Bradycardiac arrhythmia,BA)的发病率逐渐上升,以阿托品及异丙肾上腺素为代表的西药虽然能在短时间内提高心率,但不适宜长期使用。起搏器植入作为治疗BA的有效策略,由于花费昂贵,需终生随访,使患者的生活质量受到不同程度的影响,部分患者不适宜或拒绝接受此类治疗方案。因此,急需在中医药领域寻找新的有效方药,发挥中医药干预治疗BA的临床优势,为患者提供可替代的临床选择。翁维良在其师郭士魁芳香温通治疗BA的基础上开展临床探索,提出运用温阳、理气、活血的治疗思路,在前期的临床实践中取得良好疗效。因此总结翁维良治疗BA的临床经验,深入挖掘分析核心处方——元姜方,明确其临床应用的疗效特点及作用机制,将有利于发挥中医药在BA药物治疗中的积极作用,具体研究方案见图文摘要。目的研究分析翁维良全国名中医运用温阳、理气、活血法治疗缓慢性心律失常(BA)的有效人群,明确受益人群特征,建立中医药干预治疗BA的疗效预测模型,挖掘翁维良治疗缓慢性心律失常的核心处方(元姜方)药物组成,探索元姜方的可能作用靶点、通路,及发挥药理作用的主要药物成分,为元姜方的临床应用提供客观依据及分子生物学基础。方法1.临床研究部分1.1翁维良治疗缓慢性心律失常患者临床资料收集选择2016.1-2018.6在中国中医科学院西苑医院翁维良门诊就诊的缓慢性心律失常(BA)患者197例开展病例观察研究,建立温阳理气活血法治疗BA患者的临床资料数据库,分析比较诊疗前后患者心率及相关临床特征变化,划分治疗有效/无效病例。1.2有效人群特征挖掘及疗效预测模型建立运用卡方检验及交叉列联分析方法,明确温阳理气活血法治疗BA的有效人群特征,针对分析中得到的单因素显著变量开展交互作用分析,进而运用判别分析进行模型筛选,首次探索建立预测温阳理气活血法治疗BA患者属于有效/无效类概率模型。1.3有效人群核心处方挖掘运用复杂网络分析方法,对翁维良治疗BA有效病例医案进行用药频次统计及处方挖掘,确立温阳理气活血法核心处方的药物组成,命名为元姜方。1.4有效病例动态诊疗可视化分析针对翁维良治疗BA患者,开展长时诊疗随访,基于长时诊疗及随访数据,运用半定量分析方法总结影响疗效的因素,通过对医案药物-疗效相关性、患者服药情况及翁维良用药经验访谈的分析汇总,优化临床治疗方案。2.实验研究部分2.1元姜方治疗缓慢性心律失常的网络药理学分析获取元姜方6味药物的成分及候选作用靶点,与BA疾病候选靶点进行映射,得到50个药物-疾病共有基因,运用cytoscape软件构建药物-候选成分-缓慢性心律的候选靶点网络,分析药物成分与疾病作用靶点的相关性,通过ClueGO插件进行 G0 生物进程及 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析,探索元姜方的药物靶点、通路及发挥药理作用的主要药物成分。2.2创新性优化病态窦房结综合征大鼠模型的建立方法首次运用颈内静脉滴注氢氧化钠浸润损伤窦房结区及缺血再灌注损伤窦房结区两种方法,优化建立病态窦房结综合征(SSS)大鼠模型,针对传统甲醛浸润模型损伤区域较大,死亡率高,对实验人员存在损伤的问题,通过精确窦房结定位、减少周围组织损伤,提高造模成功率,通过造模后心率监测、窦房结电生理评估、病理切片及分子生物学层面,评价模型的稳定性、成功率及创新优势。2.3元姜方治疗病态窦房结综合征大鼠机制探索建立缺血再灌注损伤窦房结区病态窦房结综合征大鼠模型,将造模成功大鼠随机分为模型组、元姜方组、阿托品组、心宝丸组,每组各12只,将各组大鼠造模及给药前后心率与正常组大鼠比较,采用S1S2超速抑制分级递增法测定窦房结区窦房传导时间、窦房结恢复时间的变化,并运用western blot及钙含量比色检测研究方法验证网络药理预测靶点及SSS病理过程的关键蛋白。结果1.临床研究结果1.1翁维良治疗缓慢性心律失常患者临床疗效分析结果(1)诊疗前后,患者总心搏数(疗前76158.57±12405.13,疗后81276.63±12002.26)、平均心率(疗前55.12±9.25,疗后58.57±8.94)、最小心率(疗前 35.18±5.06,疗后 40.27±6.35),最长 RR 间期(疗前 2.3±0.84,疗后1.9±0.87),以及24小时内>2s停搏数量(疗前106.59±328.32,疗后33.84±129.5)有显著差异,p≤0.05,由于诊疗后的总心搏数,平均心率,最小心率的平均秩次大于诊疗前,提示经首诊治疗后心率有明显提高。诊疗后最长RR间期,以及24小时内>2s停搏数量的平均秩次小于诊疗前,提示经首诊治疗后RR间期缩短,停搏数减少。基于疗效分析结果,将197例接受翁维良温阳理气活血治疗的BA患者划分为有效人群(143例)及无效人群(54例)。(2)前期诊疗记录中,Hol ter结果提示最小心率<40次/min或有长间歇,且头晕、黑矇等症状明显,医生已明确建议接受起搏器治疗的患者共有162例(162/197),心率≥40次/min,但头晕、黑矇等症状频发患者共有35例(35/197)。针对162例就诊时符合起搏器植入指征患者进行描述性统计分析。首诊治疗后,共有61例患者(61/162)Holter检测结果提示,最小心率>40/min,从客观指标评估,已不符合起搏器植入标准。1.2有效人群特征分析及疗效预测模型结果根据有效及无效人群划分,(1)针对心率变化情况进行组间秩和检验,结果提示有效患者最小心率(35.67±5.20)及最大心率(84.08±20.01)与无效人群最小心率(33.48±4.17)及最大心率(91.72±21.08)组间比较差异显著。(2)针对冠心病、高血压、糖尿病、心肌炎、房颤、房早、室早7个常见合并疾病进行卡方检验及交叉列联分析,结果提示BA合并出现以下疾病a.冠心病合并高血压,b.房颤合并早搏,c.高血压合并房早是影响疗效的因素。(3)针对不同类型BA特征分析,结果提示房室传导阻滞是影响疗效的独立危险因素。运用判别分析建立预测温阳理气活血法治疗BA患者属于有效/无效类概率模型为:y=-0.2X1+0.07X2+0.16X3-0.65X1-1.12X5-0.71X6-0.75X7-0.91X8(X1=首诊服药时间,X2=平均心率,X3=最小心率,X4=冠心病,X5=房颤,X6=室早,X7=窦房传导阻滞,X8=房室传导阻滞)。1.3有效人群核心处方挖掘结果基于有效人群处方的挖掘结果提示,核心药物为高良姜、荜茇、郁金、延胡索、肉桂、干姜,将该处方命名为元姜方。其中高良姜、延胡索为君药,郁金、荜茇为臣药,肉桂、干姜为佐使药物。1.4有效病例动态诊疗可视化分析结果根据半定量分析,总结需要关注的疗效影响因素为:(1)逐步减少药味药量及减少用药频率,是更有利于诊疗起效后BA患者停药的两个方法;(2)60%典型医案中首先停用益气药物,对患者心率指标无明显影响;(3)针对BA患者,蜜麻黄的最小有效剂量多在3-6g。(4)苦参、黄连作为翁维良常用的佐使药物,虽药性偏寒,但与疗效的相关性分析结果提示,该药物无降低心率的作用,不影响处方整体疗效。2.实验研究结果2.1元姜方治疗缓慢性心律失常的网络药理学分析结果网络药理学预测结果提示,元姜方主要通过作用于SCN5A、CAV1、KCNH2、CHRM、PRL等50个作用靶点,调节肾素分泌通路及cAMP信号通路。该药理作用的发挥主要与十八烯酸、β-荜澄茄油烯、丁香烯、香树烯、胡椒碱、黄连素等药物成分密切相关。元姜方中,荜茇20个药物成分中,共有14个成分为治疗BA的有效成分,共作用于7个疾病靶点,干姜11个药物成分中,共有6个成分为治疗BA的有效成分,共作用于24个疾病靶点,高良姜的25个药物成分中,共有13个成分为治疗BA的有效成分,共作用于48个疾病靶点,在肉桂的10个药物成分中,共有6个成分为治疗BA的有效成分,共作用于23个疾病靶点,在延胡索51个药物成分中,共有39个成分为治疗BA的有效成分,共作用于37个疾病靶点,在郁金的68个药物成分中,共有11个成分为治疗BA的有效成分,共作用于46个疾病靶点。2.2病态窦房结综合征不同造模方法的评价结果(1)颈内静脉滴注氢氧化钠浸润损伤窦房结区(ISHG)造模组大鼠死亡率16.6%,缺血再灌注损伤窦房结区(IRIG)造模组大鼠死亡率为33.3%;甲醛损伤大鼠(FWCG)死亡率为80%,因术后呼吸机撤除,自主呼吸无法恢复而死亡。造模7天后仅有1只大鼠存活。(2)造模14天后,IRIG大鼠心率为290.3±37.83次/min,窦房结恢复时间(SNRT)为 302.7±41.84ms,窦房传导时间(SACT)23.00±5.41ms,ISHG 大鼠心率为328.8±40.09次/min,窦房结恢复时间为264.00±59.22ms,窦房传导时间 24.1±5.34ms;(3)造模后,两组大鼠窦房结区域均出现组织边界模糊,排列紊乱,细胞出现空泡样改变伴坏死;(4)造模后,两组大鼠窦房结细胞内钙离子浓度降低,窦房结通道蛋白HCN4和SCN5A表达均下降。2.3元姜方治疗病态窦房结综合征大鼠机制探索结果(1)元姜方对模型大鼠心率的影响结果本研究运用缺血再灌注损伤窦房结区(IRIG)造模大鼠,元姜方给药治疗14天后,心率组间比较结果:与正常组(Control)比较,模型组(Model)心率显著降低(p<0.05);与模型组(Model)比较,阿托品组(Atropine)、心宝丸组(XB)、元姜方组(YJ)大鼠心率均显著提高(p<0.01);与心宝丸组(XB)比较,阿托品组(Atropine)、元姜方组(YJ)大鼠心率均显著提高(p<0.05)。结果提示,经过14天的治疗,元姜方可显著提高大鼠心率,疗效优于阳性对照药心宝丸组。(2)元姜方对造模大鼠窦房结电生理的影响结果元姜方给药治疗14天后,SNRT组间比较:与正常组(Control)比较,模型组(Model)、心宝丸组(XB)、阿托品组大鼠SNRT显著延长(p<0.01);与模型组(Model)比较,各组大鼠SNRT均显著缩短(p<0.05);与心宝丸组(XB)比较,阿托品组(Atropine)、元姜方组(YJ)大鼠SNRT均显著缩短(p<0.01)。SACT组间比较:与正常组(Control)比较,各组大鼠SACT显著延长(p<0.01);与模型组(Model)比较,各组大鼠SACT均显著缩短(p<0.01);与心宝丸组(XB)比较,阿托品组(Atropine)、元姜方组(YJ)SACT均显著缩短(p<0.01)。(3)元姜方对SSS模型大鼠窦房结区蛋白表达及细胞内钙离子的影响结果给药14天后,与正常组大鼠相比,模型组(Model)、阿托品组(Atropine)、心宝丸组(XB)、元姜方组(YJ)大鼠窦房结区HCN4蛋白表达显著降低,与Model组比较,元姜方可提高大鼠窦房结区HCN4蛋白表达;与正常组大鼠相比,Model大鼠窦房结区SCN5A蛋白表达显著降低,元姜方可上调大鼠窦房结区SCN5A蛋白表达;与正常组大鼠相比,Model大鼠、Atropine、XB、元姜方组大鼠窦房结区CHRM2蛋白表达显著升高,与Model组比较,元姜方可降低大鼠窦房结区CHRM2蛋白表达;与正常组大鼠相比,Model、Atropine、XB、元姜方组大鼠窦房结区CHR蛋白表达显著降低,给药后各组CHR蛋白表达均有所上升。给药14天后,窦房结细胞内钙离子浓度组间比较:与正常组(Control)比较,模型组(Model)、阿托品组(Atropine)、元姜方组(YJ)大鼠细胞内钙离子浓度显著降低(p<0.05)。结论1.翁维良名老中医运用温阳、活血、理气大法治疗BA疗效明显,治疗有效率72.58%,经首诊治疗后,即有41.36%应植入起搏器治疗患者最小心率提高至40次/min以上,已无起搏器植入指征。针对有效及无效人群的特征分析提示,最小心率偏低、最大心率偏高、房室传导阻滞为影响疗效的危险因素,单纯伴有一种合并疾病并未显著影响疗效,但同时合并冠心病、高血压、房颤、早搏疾病,两种及两种以上的患者疗效欠佳。创新性运用判别分析方法建立疗效预测模型,可为今后临床中药治疗BA的受益人群特征提供参考,为中医药治疗BA的临床决策提供依据。2.基于复杂网络分析的数据统计方法,利用真实诊疗数据对翁维良治疗BA有效处方进行挖掘,确定了以温阳、理气、活血为治疗法则的元姜方(高良姜、荜茇、郁金、延胡索、肉桂、干姜),在一定程度上反映翁维良对BA病机的认识及辨治思路。3.运用半定量分析方法对个体长时诊疗方案的分析,通过逐条总结每个患者的诊疗经验及规律,最终通过个案规律汇总,可有效挖掘名老中医临床诊疗规律,并提供临床辅助决策,为中医动态治疗方案分析提供新思路,为名老中医经验传承提供循证基础。4.首次运用氢氧化钠浸润损伤窦房结区及缺血再灌注损伤窦房结区,建立病态窦房结综合征大鼠模型,可通过物理及化学损伤窦房结区,破坏了细胞膜的完整性,影响其细胞内Ca2+水平及离子通道活性,造成了窦房结自律性的降低,造成起搏电流减低,窦房结自律性降低,减缓心率。该方法优化了传统SSS甲醛损伤窦房结区定位不准确、损伤范围较大、大鼠死亡率高、对实验人员存在危害的缺点,为BA新药筛选和药物作用研究提供模型基础。5.元姜方可有效提高心率,通过缩短窦房传导时间及窦房结恢复时间改善SSS模型大鼠窦房结区电生理水平。元姜方可能通过调节自主神经功能及窦房结区域供血,提高肾上腺素及甲状腺素等神经体液激素水平,上调CRH蛋白表达,下调CHRM2蛋白表达,增加细胞内钙离子浓度,从而提高SCN5A及HCN4心肌离子通道的兴奋性,触发病理状态下右移或延长的窦房结细胞动作电位,从而提高心率。