研究背景慢性肝病的发生与发展是一个复杂的过程,包括从最初的肝细胞坏死、脂肪变性,到脂肪肝、肝纤维化并伴有肝炎,再发展为肝硬化,最终演变为肝癌或是肝功能衰竭,而肝损伤是所有的慢性肝病最初的病理状态。在肝脏从最开始的肝细胞坏死到肝脏纤维化的发展过程中,人并不会表现出太多的症状,大部分慢性肝病患者在发现问题时肝脏已经发展成为肝硬化甚至是肝衰竭。而目前临床上对于肝硬化、肝衰竭等慢性肝病的治疗手段,只针对部分病人,改善其肝脏疾病的严重程度,并无特效药可以很好的治疗此类的慢性肝病。因此,对于早期的肝损伤的治疗以及预防值得引起人们的重视。肝损伤有很多种类,根据诱导物可以分为酒精性肝损伤、免疫性肝损伤、化学性肝损伤,停止接触酒精、某些药物等会引起肝损伤的物质,对于慢性肝病的前期治疗很有帮助,然而饮酒文化在世界上的盛行、生病时必须服用药物进行治疗,再加上肝损伤并无什么症状影响人们生活,因此人们往往选择忽略这些物质对于肝脏的伤害。如果伴有肝炎,慢性肝病将不会因为停止接触诱导物而减轻病症。因此找到一种能够保护肝脏的药物,在人们不得不接触酒精、某些药物时保护肝脏,是非常有必要的。抗氧化和自噬是抗肝损伤的两种靶点。抗氧化药物在护肝药物上的运用已经非常广泛了,其机制也有了一定的研究,据了解核受体FXR可以激活Nrf2从而增加抗氧化酶HO-1、NQO1等的表达从而起到抗肝损伤的作用;自噬是细胞的一种自我保护手段,当发生肝损伤时,自噬可以通过吞噬受损伤的线粒体膜和细胞产生的活性氧,起到抗肝损伤的作用。白桦脂酸具有一定的抗氧化功能,具有低毒、高安全性等优点,被认为是一种很有前途的治疗药物,但是将白桦脂酸运用于抗肝损伤时需要较高的药物浓度,再加上白桦脂酸的水溶性很低,因此影响了白桦脂酸运用于抗肝损伤。本文研究的是一种新型的白桦脂酸核苷杂合分子,通过化学反应将白桦脂酸与核苷牢牢的结合在一起,改善白桦脂酸的抗肝损伤活性具有应用价值。研究结果充分提示,这种新型的白桦脂酸核苷杂合分子可以通过增加抗氧化活性以及增加自噬起到抗肝损伤的作用。研究目的通过在白桦脂酸的非活性部位连接核苷,探究新型化合物是否能够改善白桦脂酸抗氧化活性;探究化合物是否能够通过核苷上调小鼠肝细胞自噬水平。而抗氧化活性的增加以及自噬水平的上调都可以起到抗肝损伤作用,所以最终我们需要探究出新化合物是否具有良好的抗肝损伤活性,以及它在酒精性肝损伤中的作用机制。研究方法1.建立酒精性肝损伤、免疫性肝损伤、化学性肝损伤模型。2.检测小鼠血清ALT、AST水平,验证肝损伤模型是否建立成功,以及初步检测白桦脂酸核苷杂合分子是否具有抗肝损伤的作用并且筛选出作用最佳的模型;挑选出最佳模型后进一步检测最佳模型小鼠血清TG、CHO水平从而验证抗肝损伤效果。3.检测肝损伤指标MDA,抗氧化指标SOD、GSH-Px、CAT,探究新药是否具有抗氧化作用,为之后肝损伤机制的研究提供线索。4.制作切片,用苏木精、伊红将切片染色,做成HE染色切片,直接的反应小鼠肝脏的损伤程度。5.利用QPCR和Western Blot技术,检测小鼠肝脏抗氧化蛋白HO-1、NQO1、以及上游蛋白Nrf2、Keap1、FXR的表达,验证新药是否能够通过抗氧化起到抗肝损伤的作用;检测小鼠肝脏自噬相关蛋白Beclin1、LC3、ATG14的表达,验证新药能否通过上调自噬起到抗肝损伤的作用;检测小鼠肝脏凋亡相关蛋白Caspase3、Bc12的表达,从分子水平验证新药是否具有抗肝损伤作用。6.挑选最佳模型小鼠取肝脏,制作成切片,利用免疫荧光法,制作小鼠LC-3组织切片,进一步验证新药对自噬的影响。研究结果1.3种小鼠模型血清ALT、AST结果显示模型组高于空白组,阳性药组低于模型组,给药组低于阳性药组,并且酒精性肝损伤模型的给药组与模型组对比,其ALT、AST-水平下降程度多于免疫性肝损伤、化学性肝损伤模型,因此接下来挑选酒精性肝损伤模型进一步验证白桦脂酸核苷杂合分子抗肝损伤的作用机制。2.小鼠血清TG、CHO结果显示,模型组血清TG、CHO高于空白组,阳性药组低于模型组,给药组低于阳性药组。3.小鼠肝脏MDA、SOD、GSH-Px、CAT检测结果显示,模型组MDA水平明显上升,而SOD、GSH-Px、CAT水平明显下降,而阳性药组MDA水平下降,给药组水平低于阳性药组,阳性药组SOD、GSH-Px、CAT水平上升,给药组SOD、GSH-Px、CAT水平高于阳性药组。4.HE染色结果显示,模型组存在多处的肝细胞灶状坏死以及点状坏死,提示肝细胞存在严重损伤,阳性药组肝细胞点状坏死有所下降,给药组中高剂量组的点状坏死程度明显低于阳性药组,而中低剂量组还存在少量的点状坏死,与阳性药组相似。5.Western Blot 结果显示模型组蛋白 FXR、Nrf2、HO-1、NQO1、Beclin、LC-3、ATG14、Bc12水平明显下降,而各个给药组这些蛋白的水平明显上升且呈现一定的剂量依赖,而蛋白Keap1、Caspase3在模型组中水平明显上升,而在给药组中明显下降且呈现一定的剂量依赖性。6.QPCR 结果显示模型组 FXR、Nrf2、HO-1、NQO1、Beclin、LC-3、ATG14、Bc12的mRNA水平明显下降,且各个给药组这些mRNA的水平明显上升呈现一定的剂量依赖,而Keap1、Caspase3的mRNA在模型组中水平明显上升,而在给药组中明显下降且呈现一定的剂量依赖性。7.免疫荧光结果显示小鼠肝脏LC-3II,数量明显的上升。研究结论1.新型白桦脂酸核苷杂合分子可以改善小鼠酒精性肝损伤、免疫性肝损伤、化学性肝损伤,且对于酒精性肝损伤的效果优于免疫性肝损伤和化学性肝损伤。2.新型白桦脂酸核苷杂合分子可以通过激活FXR从而增加肝细胞抗活性氧酶的表达,从而中和肝损伤产生的活性氧起到抗肝损伤的作用。3.新型白桦脂酸核苷杂合分子可以通过激活自噬,增加肝损伤时自噬的水平,激活细胞的自我保护功能,起到抗肝损伤的作用。4.新型白桦脂酸核苷杂合分子可以降低肝细胞凋亡相关蛋白的表达,抑制肝细胞的凋亡,保护肝细胞。