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反式-4-羟基-L-脯氨酸是自然界中分布最普遍的一种羟脯氨酸,在医药、化工、食品和美容业等领域均有广泛应用。本文以已构建好的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株——大肠杆菌BL21(DE3)/p UHT4为出发菌,在添加外源脯氨酸生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的前提下,对该菌进行菌种改造及发酵用培养基的优化,以期提高生产效率,降低生产成本。具体研究内容如下:在质粒p UHT4的基础上,构建出脯氨酸-4-羟化酶基因与透明颤菌血红蛋白基因(vgb基因)的共表达质粒p UHVT4,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在GT培养基中进行摇瓶发酵。发现vgb基因能有效促进菌体的生长及羟脯氨酸的生成,大肠杆菌BL21(DE3)/p UHVT4的OD600及羟脯氨酸产量在24 h时分别达到10.25±0.37和2.18±0.11 g/L,比大肠杆菌BL21(DE3)/p UHT4的分别提高了47%和29%。以玉米浆为有机氮源替换GT培养基中的胰蛋白胨,并进行单因素及正交实验优化,得到摇瓶发酵的最佳培养基组成:葡萄糖8 g/L、甘油10 g/L、玉米浆8 g/L、硫酸铵13 g/L、磷酸氢二钾1.5 g/L、氯化钠2 g/L、硫酸镁0.3 g/L、氯化钙0.015 g/L、硫酸亚铁4 m M。优化后的培养基被命名为GC培养基,摇瓶培养24 h后,羟脯氨酸产量达到1.27±0.05 g/L,与优化前的培养基相比,产量提高了41%。使用Red/ET同源重组系统敲除大肠杆菌W3110和BL21(DE3)中的put A基因,阻断大肠杆菌的脯氨酸降解途径,从而阻止菌体对外源添加的脯氨酸的降解,降低生产成本。摇瓶实验结果表明,put A基因缺失型菌株不能降解脯氨酸。在摇瓶水平测定put A基因的缺失在GT和GC培养基中,对脯氨酸转化的影响,发现put A基因缺失型菌株能将被消耗的脯氨酸全部转化为羟脯氨酸,脯氨酸的有效转化率为100%,而野生型菌株的只有52%-65%;并在摇瓶水平测定vgb基因在put A基因缺失型菌株中,对羟脯氨酸生产的影响,发现vgb基因能有效提高羟脯氨酸的产量;两次摇瓶实验均表明,大肠杆菌W3110不适合作为羟脯氨酸的生产用菌株。最后在7 L的发酵罐中比较大肠杆菌BL21(DE3)Δput A/p UHVT4在GT与GC培养基中的羟脯氨酸生产情况,结果表明1.6 g/(L?h)的补糖速率不适合于利用GT培养基发酵生产羟脯氨酸,而此时GC培养基的效果较好,发酵80 h后,羟脯氨酸的产量达到45.23 g/L。