【摘 要】
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背景肿瘤的转移是一个特殊而又复杂的过程,是造成肿瘤治疗失败,导致患者死亡,致使肿瘤致死率居高不下的重要因素。肿瘤的转移有寡灶型转移（全身累积转移灶数目或者全身累积转移器官不超过5个）和多灶型转移（全身累积转移灶数目或者全身累积转移器官超过5个）之分。寡灶转移和多灶型转移是肿瘤转移的第二阶段——远位转移的两种转移形式。在这个阶段,要形成新的肿瘤生长的微环境。影响形成肿瘤生长的微环境的因素有很多,其中
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背景肿瘤的转移是一个特殊而又复杂的过程,是造成肿瘤治疗失败,导致患者死亡,致使肿瘤致死率居高不下的重要因素。肿瘤的转移有寡灶型转移（全身累积转移灶数目或者全身累积转移器官不超过5个）和多灶型转移（全身累积转移灶数目或者全身累积转移器官超过5个）之分。寡灶转移和多灶型转移是肿瘤转移的第二阶段——远位转移的两种转移形式。在这个阶段,要形成新的肿瘤生长的微环境。影响形成肿瘤生长的微环境的因素有很多,其中癌细胞通过自身分泌影响肿瘤微环境建立是一种途径,然而这方面的机制研究目前还很模糊。miRNA是一种内源性非编码单链小RNA分子,对肿瘤转移具有多种重要的调控作用。miRNA可通过影响癌细胞自身分泌,从而改变肿瘤生长的微环境,影响远位转移的肿瘤克隆性增殖和肿瘤转移灶的形成。但RNA分子极易在细胞外被降解。外泌体由各种类型的细胞分泌,广泛存在并分布于各种体液中,能够携带各种RNA并保护其免遭降解,与多种疾病的发生与进程密切相关。目前研究表明肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤的发生发展的调控,起到细胞间物质转运和信息传递的生理功能,重塑肿瘤微环境。但外泌体对肿瘤的具体作用及其调节机制尚不明确仍需深层次研究。目的1.探索外泌体对寡灶型转移向多灶型转移演变的影响。2.验证外泌体携带的miRNA对肿瘤转移的调控作用。3.研究外泌体携带的miRNA在肿瘤克隆增殖过程中的分子机制。方法1.通过共培养模拟体内多灶型转移对寡灶型转移的影响。2.通过超速离心的方法提取外泌体。3.通过TEM、NTA、WB检测外泌体。4.通过si RNA转染的方法瞬时敲低目的基因。5.通过miRNA mimics转染或慢病毒感染的方法瞬时或稳定过表达目的基因。6.通过RNA提取和RT-qPCR的方法检测目的基因表达水平。7.通过细胞迁移实验、细胞侵袭实验和克隆斑形成实验检测肿瘤细胞的体外迁移增殖能力。8.通过共聚焦荧光显微镜观察细胞摄取外泌体的变化。9.通过高通量测序的方法检测外泌体中miRNA表达水平的变化。10.通过KEGG数据库、TCGA数据库、Target Scan Human数据库、GEPIA数据库、Onco Lnc数据库和华大基因多组学系统进行生物信息学分析。11.通过流式细胞术分析细胞周期的变化。结果1.通过建立的体外寡灶型转移肿瘤细胞和多灶型转移肿瘤细胞的共培养模型,多灶型转移肿瘤细胞通过分泌外泌体在体外介导寡灶型转移向多灶型转移的演变过程。2.在远位转移阶段,多灶型转移肿瘤细胞分泌的外泌体可以增强寡灶型转移肿瘤的体外迁移、侵袭、克隆增殖能力。3.外泌体可以通过运输miRNA调控寡灶型转移向多灶型转移的演变过程。高通量测序分析,寡灶型转移肿瘤细胞和多灶型转移肿瘤细胞分泌的外泌体携带的miRNA存在着不同。4.外泌体携带的miR-199a-1-5p可以明显地促进寡灶型转移肿瘤细胞的体外迁移、侵袭、克隆增殖能力。5.CDKN1B基因是miR-199a-1-5p的靶基因。miR-199a-1-5p可以通过抑制CDKN1B基因的表达水平,从而增强寡灶型转移肿瘤细胞的体外迁移、侵袭、克隆增殖能力,诱导G1期向S期转变。结论1.本研究验证了在远位转移阶段,多灶型转移肿瘤细胞通过分泌外泌体在体外调控寡灶型转移向多灶型转移的演变过程,增强寡灶型转移肿瘤细胞的迁移、侵袭、克隆增殖能力。首次证明可以通过外泌体分泌调控细胞周期介导寡灶型转移向多灶型转移的进展2.本研究首次证明并验证了外泌体通过运输miR-199a-1-5p抑制CDKN1B促进肿瘤转移的分子机制。外泌体通过运输miR-199a-1-5p,增强寡灶型转移肿瘤细胞的miR-199a-1-5p的基因表达,从而抑制CDKN1B基因的表达水平,最终增强寡灶型转移肿瘤细胞的体外迁移、侵袭、克隆增殖能力,诱导G1期向S期转变。这一分子机制和以往外泌体通过运输miR-199a-1-5p抑制肿瘤转移的分子机制完全不同,首次证明了外泌体可以通过运输miR-199a-1-5p抑制CDKN1B的基因表达,诱导G1期向S期转变,促进肿瘤转移增殖。首次证明CDKN1B是寡灶型转移向多灶型转移的演变过程中的抑制因子。这为研究肿瘤转移,尤其是外泌体介导的肿瘤转移提供新的研究思路。3.本研究用的寡灶型转移和多灶型转移模型来源于M14黑色素瘤细胞,所以本研究首次证明miR-199a-1-5p可以通过抑制CDKN1B促进黑色素瘤转移增殖。
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