研究背景Epstein-Barr virus(EBV)是由Epstein和Barr于1964年首次在非洲儿童Burkitt淋巴瘤细胞中发现,在全球范围内广泛感染的疱疹病毒,属于疱疹病毒-4家族。儿童原发EBV感染很常见(VCA-IgG阳性率可达90%),大多数EB病毒的原发感染为急性感染,可无症状或表现为传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis,IM),但在个别情况下EBV感染后可出现慢性或复发性IM样症状,伴随EBV抗体的异常改变,即慢性活动性EBV感染(chronic active Epstein-Barr virus infection,CAEBV)。最初的关于CAEBV患儿的报道始于二十世纪八十年代初,CAEBV感染主要发生在小儿,而成年以后很少发病;CAEBV感染在亚洲发病率高,随访8月至12年死亡率43%,而且与多种临床疾病,特别是与EBV相关的T、NK淋巴细胞增殖综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和恶性淋巴瘤等预后不良的疾病密切相关,所以CAEBV越来越受到研究者们的关注。目前确切的诊断CAEBV和探讨其发病机制是临床上研究的两个热点。临床上在诊断CAEBV时发现,EBV抗体谱呈多样性,与EBV-DNA测定存在不一致的现象,如有些CAEBV患儿本身免疫球蛋白就低或并发严重的脾亢等情况时可以缺乏EBV抗体的上调,而实时定量PCR则发现病毒拷贝数明显增加;有的虽然EBV抗体很高,但也不能排除其他因素引起的交叉反应。不同的病程时间抗体也会有自身的起落消长。因此,CAEBV患儿在抗原方面的检测就显得较为重要,进一步研究CAEBV究竟在抗原检测方面有哪些区别于急性EBV感染和正常儿童的特点有助于明确CAEBV的诊断。AEBV血液学方面的诊断包括外周血白细胞升高且以淋巴细胞升高为主、异型淋巴细胞＞10%,而进一步淋巴亚群分析往往提示这些增多的细胞为CD38~+DR~+CD8~+的T淋巴细胞。而CAEBV在血液学和淋巴亚群方面是否有可以协助CAEBV临床诊断的、不同于AEBV和正常儿童的特点,至今还没有这方面的报道。外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC)总DNA水平一样的患儿不等于EBV在各种淋巴细胞的感染程度和引起的免疫细胞应答一样,有报道EBV感染T细胞为主型与CAEBV的高死亡率呈正相关性,需要早行骨髓移植等的更积极的治疗方案。国内常规的检测外周血EBV-DNA的方法不能区分EBV感染的淋巴细胞种类,进而不能明确CAEBV患儿EBV更具体的感染情况,因此明确CAEBV的感染细胞类型,帮助CAEBV的临床分型诊断,可能对更深入的研究其病毒学发病机制、指导个体化诊治及判定预后有重要意义。关于CAEBV的发病机制方面,病毒抗原自身和宿主两方面的因素导致EBV免疫逃逸的机制在CAEBV的发病过程中可能起了重要作用。宿主针对EBV的正常免疫应答包括固有免疫和获得性(又称适应性)免疫。国外研究显示,宿主的适应性细胞免疫应答特别是EBV特异的CD4~+T细胞应答和CD8~+T细胞应答对EBV的清除和疾病的转归有着重要意义,而CAEBV患儿存在细胞免疫功能紊乱与其病情慢性活动性相关。但目前的研究大多局限于针对CAEBV患儿CD4~+T细胞、CD8~+T细胞和NK细胞的变化进行分析,尚没有CAEBV的T细胞功能亚群、调节亚群、初始(又称纯真)记忆亚群和激活亚群的研究。目的1.从EBV抗原诊断、感染细胞分型诊断、血液学和淋巴细胞亚群方面、血清学及EBV特异的CTL方面阐明CAEBV的特点,协助CAEBV的诊断。帮助临床医师对CAEBV的疾病特点有更深入的认识,做出更确切的诊断和鉴别诊断,为指导治疗和判定预后奠定基础。2.从EBV侵犯的淋巴细胞种类、外周血淋巴细胞亚群、EBV特异的适应性免疫应答功能方面探讨CAEBV的免疫逃逸机制,从细胞和分子免疫学水平明确CAEBV的发病机制,协助针对性的进行个体化诊治和判定预后。方法1.收集2004年3月至2008年4月在我院住院的CAEBV患儿10例,AEBV患儿13例,以及VCA-IgG阳性的正常儿童12例的血清和PBMC,并收集临床资料。2.实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)的方法检测各组PBMC的EBV-DNA水平。3.免疫磁珠法从PBMC中分选CD4~+T、CD8~+T、CD19~+B、CD56~+NK细胞,行qPCR和荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)明确EBV感染各种细胞的阳性情况和EBV-DNA在各种淋巴细胞的浓度。4.Beckman流式细胞分析仪检测各组PBMC的NK、T、B淋巴细胞亚群以及T细胞功能亚群、激活亚群、纯真记忆亚群和调节亚群。并血常规检查外周血白细胞和淋巴细胞。5.应用德国IBL公司酶联免疫吸附实验(enzyme link immunosorbnent assay,ELISA)试剂盒检测EBV各种抗体和嗜异凝集试验,并对EA-IgG和EBNA-1-IgG进行抗体稀释实验。6.应用酶联免疫斑点检测法(enzyme link immune spot assay,ELISPOT)检测各组体外培养的PBMC针对EBV肽段库刺激的特异CTL合成和分泌IFN-γ功能的差异。7.统计学方法:采用SPSS13.0分析软件,多组比较采用单因素方差分析(one-wavANOVA),两组比较应用非参数检验或独立样本-T检验,进行统计分析,p＜0.05视为差异有统计学意义。结果1.CAEBV组EBV-DNA载量为6.81×107±1.1×108 copies/ml,AEBV组EBV-DNA载量为1.32×10~6±1.6×10~6 copies/ml,两组比较有明显差异,CAEBV组PBMC的EBV-DNA水平明显高于AEBV组(P＜0.01)。2.7例CAEBV患儿做细胞分选及FISH和qPCR后,发现EBV可以引起B细胞、NK细胞、CD4~+和CD8~+T细胞不同程度的感染,临床表现为反复或持续的IM样症状。6例病人以感染T细胞为主,其中1例以CD8~+T细胞感染为主,临床表现除高热,肝脾淋巴结大,伴严重的血液系统一系或三系降低外,还并发了爆发性的致死性T淋巴细胞增殖综合征而死亡。1例以NK细胞感染为主,临床表现还伴有对蚊虫叮咬高度敏感且IgE高达2500 u/ml。AEBV组7例病人均显示感染B淋巴细胞,临床表现为可以痊愈的IM。6例正常儿童均为阴性。3.CAEBV组外周血白细胞、淋巴细胞、NK细胞、总T细胞、CD4~+T细胞和CD8~+T细胞计数均较其他两组明显减低(p＜0.01),而B细胞的计数较正常组无差别,但较AEBV组明显下降(p＜0.01)。4.功能亚群:CAEBV组较正常组CD28~+CD4~+比例下降(p＜0.01),但较AEBV组升高(p＜0.01),而CD28~+CD8~+细胞的比例较正常组无明显变化。5.调节亚群:CAEBV组较正常组CD4~+CD25~+细胞的比例上升(p＜0.01),但较AEBV组CD4~+CD25~+细胞的比例明显下降(p＜0.01)。6.初始记忆亚群:CAEBV组CD4~+/CD8~+CD62L~+CD45RA~+初始T细胞比例较正常组下降(p＜0.01),其CD4~+/CD8~+CD62L~-CD45RO~+效应记忆T细胞的比例较AEBV组明显降低(p＜0.01),而CD4~+CD62L~+CD45RO~+中央记忆T细胞比例明显较其他两组升高(p＜0.01),CD8~+CD62L~-CD45RA~+假初始T细胞比例较其他两组明显升高(p＜0.01),CD8~+CD62L~+CD45RO~+中央记忆T细胞的比例较其他两组明显升高(与正常组比较,p＜0.01;与AEBV组比较,p＜0.05)。7.激活亚群:CAEBV组较正常组CD38~+CD8~+和DR~+CD8~+细胞的比例均升高(p＜0.01),但较AEBV组下降(p＜0.01)。8.CAEBV的VCA-IgA、EA-IgA、高亲和力的EA-IgG明显较正常组升高(P＜0.01),且其嗜异凝集试验阴性。9.虽然AEBV感染和CAEBV感染EBNA-IgG抗体均较正常组减少(P＜0.01),但CAEBV感染产生的EBNA-IgG抗体亲和力较AEBV感染时高(P＜0.01)。10.CAEBV组较VCA-IgG阳性正常组针对EBV肽段库的特异CTL的功能明显下降(P＜0.01)。结论1.本研究发现实时荧光定量PCR检测EBV载量是临床上灵敏度和特异性均很高的诊断我国CAEBV患儿和监测EBV感染不同临床转归的的分子生物学检测方法。2.严重的CAEBV是以不同程度地对B细胞、NK细胞、CD4~+和CD8~+T细胞的同时感染为特点,病变呈多克隆或寡克隆增殖趋势,临床表现为反复或持续的IM样症状,预后较差,而AEBV患儿仅感染B细胞,临床表现为可以痊愈的IM。临床检测EBV感染的不同淋巴细胞类型对指导临床个体化诊治和评估病情进展情况有重要意义。3.CAEBV患儿体内存在多种淋巴细胞亚群失衡和细胞免疫功能紊乱,这可能与CAEBV的慢性活动性有关。检测外周血液学和淋巴细胞亚群有助于CAEBV的诊断和鉴别诊断。4.VCA-IgA、EA-IgA、高亲和力EA-IgG的增加以及EBNA-1-IgG的减少是CAEBV时EBV特异的适应性体液免疫应答的特点,检测VCA-IgA、EA-IgA、EA-IgG、EBNA-1-IgG的浓度和亲和力是CAEBV的诊断和鉴别诊断的很有意义的指标。5.CAEBV的EBV特异CTL功能较VCA-IgG阳性的正常儿童下降是其EBV特异的适应性细胞免疫应答的特点6.CAEBV存在许多不同于AEBV和VCA-IgG阳性的正常儿童的EBV特异的适应性免疫应答的特点,一方面有着协助诊断和鉴别诊断的意义,另一方面可能与CAEBV的免疫逃逸机制和病程慢性活动性有关。