豆状带绦虫呈世界性分布,成虫寄生于犬、狐狸等终末宿主的小肠,中绦期幼虫----豆状囊尾蚴寄生于家兔等兔形目动物的肝脏被膜、胃大网膜和肠系膜等部位,可引起家兔消瘦和抗病力减弱,甚至死亡。中国是世界养兔大国,兔豆状囊尾蚴病在我国广泛流行,给养兔业带来了巨大的经济损失。由于豆状囊尾蚴病无明显的临床症状,生前诊断较困难,其防治仍以药物为主。化学药物的长期使用容易导致虫株产生耐药性和兔产品中药物的残留,这不仅潜在地威胁着人类健康,同时也给豆状囊尾蚴病的防治带来困难。目前,对豆状带绦虫及其囊尾蚴病的研究多集中于病原学、流行病学调查和药物治疗,而该虫种的生前诊断和免疫防治研究未见相关报道。因此,本论文对豆状带绦虫种群遗传结构、转录组及功能基因进行了系统分析和研究,期望为豆状囊尾蚴病的诊断和免疫防治提供基础资料。主要研究工作和结果如下：1.基于线粒体基因cox2和nad4对四川地区豆状带绦虫种群遗传多样性的分析对采自中国四川7个不同地理区域(雅安、攀枝花、乐山、广元、泸州、广安和阿坝州)的23株兔豆状囊尾蚴进行了种群遗传多样性分析。PCR扩增了获得的cox2(468bp)序列中存在21个变异位点,核苷酸序列的变异率为0-3.0%,检测到5个单倍型,单倍型多样性(Hd)和核酸多样性(Pi)分别为0.451和0.00536。nad4(1,077bp)基因部分序列中有32个变异位点,核苷酸序列的分歧度为0-2.9%,检测到7个单倍型,单倍型间的Hd值和Pi值分别为0.625和0.00538。构建的NJ/MP进化树表明7个种群的系统发生与地域分布没有相关性,遗传多样性较低。2.基于线粒体基因cytb对四川地区豆状带绦虫种群遗传结构的分析采用PCR技术获得了四川8个不同地理区域(雅安、成都、攀枝花、乐山、广元、泸州、广安和阿坝州)的53株兔豆状囊尾蚴的cytb基因部分序列(922bp),并对其种群遗传结构进行了分析。cytb序列中共检测到12个单倍型,地域内分离株的变异占总变异的98.43%,地域间分离株的变异占1.57%。地域间分离株的遗传多样性和遗传分化较低,其遗传分化和基因流与它们的地理分布没有相关性,推测这8个地域株可能属于一个较大的种群。同时,NJ树和MrBayes树显示8个地域分离株均未形成明显的地理聚类,但单倍型聚类较为明显。种群动态分析结果表明,四川不同地理区域兔豆状囊尾蚴在过去的传播过程中群体规模可能保持稳定,推测相邻单倍型间的突变时间约开始于更新世晚期。3.基于线粒体基因coxl和nadl对四川地区豆状带绦虫种群结构的分析为探讨四川不同地理区域(雅安、成都、攀枝花、乐山、广元、泸州、广安和阿坝州)的61株兔豆状囊尾蚴的种群遗传结构,本文采用PCR技术获得了coxl (1,427bp)和nadl (738bp)基因的部分序列,并将两个基因串联后进行分析。结果表明：串联序列中共检测到5个单倍型,推测相邻单倍型间的突变时间约开始于更新世晚期,地域内分离株的分子遗传变异是变异的主要来源。除泸州分离株不存在变异外,其余地域内的分离株均存在较低的遗传多样性。地域间分离株遗传分化中等,地理分布特点与其遗传分化和系统发生没有相关性,推测8个地域分离株可能来源于一个较大的种群。核苷酸序列不配对差异分布曲线呈现多峰,推测四川不同地理区域兔豆状囊尾蚴在过去传播过程中群体规模保持稳定。4.豆状带绦虫转录组的研究采用第二代测序技术(Illumina sequencing)获得了豆状带绦虫成虫转录组数据库,将获得的267万条clean reads组装后得到72,957条unigeneso与四个蛋白质数据库(nr, Swiss-Prot, COG和KEGG)的相似性分析结果表明：26,012条unigenes(去冗余)与已知蛋白具有同源性,其中15,920条unigenes匹配到203个KEGG代谢通路。豆状带绦虫转录组数据库中的72,957条unigenes与猪带绦虫的30,700条ESTs以及细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫间保守的1,058条ESTs比较分析后,得到了4种绦虫共有功能基因的分布特征。豆状带绦虫转录组中大量保守基因的鉴定,为豆状囊尾蚴病的生前诊断和免疫防治抗原的筛选奠定了基础,同时为绦虫功能基因组学、免疫学和基因表达谱的研究提供了基础资料。5.豆状带绦虫TpFABP基因的克隆表达及重组抗原Dot-ELISA诊断方法的建立根据已知带科绦虫的FABP抗原基因的序列设计特异性引物,通过PCR扩增获得了豆状囊尾蚴FABP基因的开放阅读框402bp。将TpFABP基因片段插入pET32a原核表达载体,经过IPTG诱导在BL21(DE3)型大肠杆菌中表达,获得约36.1kDa的目的蛋白。免疫印迹结果表明该重组蛋白能与兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异结合。免疫组化结果显示,TpFABP蛋白在成虫的核周胞质和豆状囊尾蚴的囊壁层组织中表达。此外,通过TpFABP重组抗原建立了家兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法。对169份家兔血清的检测结果表明,该方法具有较高的敏感性(93.22%)和特异性(94.21%)。6.豆状带绦虫Tp18基因的克隆表达与重组蛋白对家兔的免疫保护效果研究从豆状带绦虫转录组数据库中筛选到Tpl8基因,以激活的豆状带绦虫六钩蚴的cDNA为模板,采用RACE技术扩增得到378bp的cDNA序列。构建的pET32a/Tp18原核表达载体,经IPTG诱导获得分子量约为33kDa的重组蛋白。重组蛋白能与兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。利用纯化后的Tpl8重组蛋白进行家兔豆状囊尾蚴病免疫保护实验,重组蛋白免疫组的减虫率为95.59%和97.38%,并产生了特异性的体液免疫应答抗体IgG。7.豆状带绦虫TpcCl基因的克隆表达及重组抗原Dot-ELISA诊断方法的建立以豆状带绦虫转录组数据库中TpcC1基因的unigene为模板设计特异引物,采用RACE技术从激活六钩蚴的cDNA中获得了TpcCl基因的序列。TpcC1基因的编码区为1,044bp,编码347个氨基酸。通过构建的原核表达载体pET32a/TpcCl,获得了分子量为58.3kDa的重组蛋白。经免疫印迹检测,该重组蛋白能与兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。利用该重组蛋白建立了家兔豆状囊尾蚴病重组蛋白Dot-ELISA诊断方法,对169份家兔血清进行检测结果显示具有较高的敏感性(94.55%)和特异性(96.49%)。