循环肿瘤细胞(CTCs)的分离与分析在癌症早期诊断、分析、治疗及预后方面具有重要价值。微纳技术的快速发展为CTCs的分离和分析提供了有力的技术支撑。然而,现有的微纳技术在捕获肿瘤细胞纯度、小尺寸肿瘤细胞的分离与鉴定及大体积血液样本的处理等方面还需进一步发展。本论文从滤膜上微孔结构的设计、荧光微球介导的肿瘤细胞分离与鉴定、多层滤膜磁分离等思路着手,研究了应用微纳技术制备的过滤装置对CTCs的分离与分析,为微纳技术在癌症诊断和临床试验中提供了可靠的实验依据。(1)四棱台状微孔可以有效提高捕获的肿瘤细胞的纯度基于亲和性的捕获虽然纯度较高,但其通量较低,而且一旦肿瘤细胞发生上皮-间质之类的转化,其捕获效率则大大降低。利用细胞物理特性对血液样本中的CTCs进行分离的一种简单有效的方法就是过滤,而现阶段研究者制备的各种滤膜分离出的CTCs纯度还不能满足要求。为此,本研究制备了一个集成了硅基滤膜的微流控过滤装置,在用于从全血样品中分离CTCs时表现出了出色的捕获效率和卓越的富集纯度。本研究通过微纳加工制备了四棱台状微腔阵列的硅基滤膜。本研究设计了微孔的结构,以有效富集肿瘤细胞,同时允许血细胞变形并通过。掺入1 m L全血中的MCF-7,SW620和Hela细胞的捕获效率约为80%,而截留在滤膜上的白细胞低于0.003%。此外,这种微流控装置还成功检测到5/6名患者血液样本中的CTCs,每毫升范围为5-86个。这些结果表明,该一次性微流控装置可以有效地富集具有不同大小和各种形态的肿瘤细胞,同时保持高捕获效率和纯度。因此,这种无标记技术可作为通用平台,以促进各种生化应用中CTCs的分析。(2)荧光微球不但有助于提高小尺寸肿瘤细胞的捕获效率,还可以用于肿瘤细胞的鉴定基于尺寸的过滤法分离血液中的CTCs是基于CTCs通常大于血细胞,并且低于预定大小阈值的细胞都可以通过滤膜而被去除。但是有些CTCs的尺寸几乎与白细胞(WBCs)相同甚至更小,因此很难通过尺寸来对其进行分离检测。为此,在我们制备的四棱台状微孔阵列的基础上,本研究设计了一种荧光微球介导的CTCs分离和分析方法。此方法不仅可以对癌症病人血液中的CTCs(特别是小尺寸CTCs)进行分离,而且还可以在无需免疫染色的情况下实现对CTCs的鉴定。该方法使用了可以选择性结合CTCs的抗体功能化荧光聚苯乙烯微球,CTCs和荧光聚苯乙烯微球的结合形成了CTCs和荧光聚苯乙烯微球的复合物,因此CTCs被尺寸放大的同时也被荧光标记。然后使用硅基四棱台状微孔阵列过滤装置可以有效对微球标记的CTCs进行分离,同时允许血细胞变形并通过。使用此方法,在18例转移性结直肠癌患者中的15例中分离并检测到CTCs。这种方法将为CTCs的分离和鉴定开辟新的可能性,并可以作为一个多功能平台,促进各种生物医学应用中CTCs的分析。(3)高密度梯度磁场分离装置连续对血液中的循环肿瘤细胞进行分离由于现有技术只能对少量血液(几毫升)进行处理,可能会因为所采集的血液中没有CTCs存在而造成漏检。为此,本研究制备了一种高通量的高密度梯度磁分离装置,用于连续对血液中的CTCs进行分离。在我们先前制备的过滤装置的基础上,本研究设计了多层过滤结构。过滤腔室中放置的镍基滤膜的孔径从上到下逐渐减小,在提高分离效率的同时避免了堵塞。本研究还在镍基滤膜上铺满了功能化的磁珠,使滤膜不再是一个二维的平面,更有利于对CTCs的特异性捕获。实验表明,我们的高密度梯度磁分离装置可以对大体积血液进行处理,有连续对血液中CTCs进行去除而达到切断肿瘤转移途径的潜力。总体研究结果表明,通过对滤膜上的孔结构进行设计可以有效提高分离出的肿瘤细胞的纯度,而将功能化的荧光微球与滤膜相结合不但有助于小尺寸肿瘤细胞的分离,而且无需进行免疫染色即可对分离出的肿瘤细胞进行鉴定。通过使用多层滤膜磁分离,可以避免传统单层滤膜处理大量样本溶液时的堵塞现象,有助于获得大量的CTCs样本用于后续的核酸分析和药敏实验,还有望用于连续去除血液中的CTCs从而切断肿瘤转移途径。