多糖具有抗病毒、增强免疫、抗肿瘤等多种生物活性,尤其是具有抗病毒和增强免疫活性,显示了广阔的药用前景。硫酸化多糖是一类糖羟基上带有硫酸根的多糖,比天然多糖具有更多、更强的生物活性。为提高中药多糖的生物活性,可通过硫酸化修饰的方法进行结构改造,获取更多的硫酸化多糖。本研究选择香菇多糖(Lentinan, LNT)作为研究对象,提取纯化,用氯磺酸-吡啶法修饰,以3种修饰条件制备了3种硫酸化LNT,以天然LNT为对照,比较它们的抗病毒和增强免疫活性,并与本研究室前期筛选的硫酸化黄芪多糖、硫酸化淫羊藿多糖、硫酸化当归多糖和硫酸化枸杞多糖进行了比较。试验分为以下九个部分：试验I香菇多糖的提取和纯化用超声水煎-醇沉法提取粗香菇多糖,然后用Sevag法去蛋白、H202法去色素、SephadexG-200柱层析纯化香菇多糖。分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮兰法测定纯化过程中多糖和蛋白含量。结果表明,粗香菇多糖的提取率为8.4%、多糖含量和蛋白含量分别为30%和65%,随着去蛋白过程的重复,多糖得率和蛋白含量逐渐降低,多糖含量逐渐升高,纯香菇多糖的得率为0.6%,多糖含量高达91.0%,蛋白质含量降低至5.3%。试验Ⅱ香菇多糖的硫酸化修饰用氯磺酸-吡啶法对纯化的香菇多糖进行硫酸化修饰,以产物的得率和硫酸基取代度为指标,对氯磺酸-吡啶比例、反应温度和反应时间进行优选。结果显示,反应温度60℃、反应时间4 h、氯磺酸和吡啶比例在1：6～1：2时为最佳修饰条件。采用最佳反应温度、反应时间和3种氯磺酸-吡啶比例(1：2、1：4和1：6)制备3种硫酸化香菇多糖(Sulfated lentinan, sLNT)sLNT1、sLNT2和sLNT3,产物得率分别为62.5%、60.5%、63.5%,硫酸基取代度分别为1.37、0.98、0.69。试验Ⅲ硫酸化香菇多糖对NDV、IBDV和IBV感染细胞能力的影响为了比较3种硫酸化香菇多糖sLNT1、sLNT2和sLNT3的体外抗病毒作用,首先用MTT法测定3种硫酸化香菇多糖和LNT对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度；然后将4种多糖在安全浓度下稀释5个浓度,分别以3种方式(先加多糖、先加病毒、多糖和病毒感作后加入)加入到CEF的培养体系中,用MTT法比较它们对鸡新城疫病毒、传染性法氏囊病毒和传染性支气管炎病毒感染细胞能力的影响。结果表明,硫酸化香菇多糖在所选浓度0.4μg·mL-1～5.9μg·mL-1范围内都可以增强CEF抵抗病毒感染,而香菇多糖多数在1.5μg·mL-1～5.9μg·mL-1范围内有效,且在同一多糖浓度下硫酸化香菇多糖组A570值显著高于香菇多糖组,表明香菇多糖经硫酸化修饰可以增强CEF抵抗病毒感染的能力；硫酸化香菇多糖增强CEF抵抗病毒感染的效果与其浓度有关,硫酸化多糖浓度在5.9、3.0、1.5、0.8、0.4μg·mL时作用效果依次降低；三种加药方式以先加多糖方式作用效果较好,3种硫酸化香菇多糖中以sLNT2抑制病毒感染细胞的作用最强。试验Ⅳ硫酸化香菇多糖对鸡淋巴细胞增殖的影响为了比较3种sLNT的体外增强免疫作用。将3种sLNT和LNT分5个浓度,分别单独或与ConA、PHA一起加入到鸡外周血淋巴细胞、单独或与ConA、LPS一起加入到鸡脾脏淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果表明,三种sLNT在所选浓度内基本都有效,而LNT有效浓度多在1.5μg·mL-1～5.9μg·mL-1范围内,且在同一多糖浓度下硫酸化香菇多糖组A570值多显著高于香菇多糖组,表明LNT经硫酸化修饰后可以提高其促进鸡淋巴细胞增殖能力,且有一定的浓度依赖性,三种sLNT浓度在5.9、3.0、1.5、0.8、0.4μg·mL-1时作用效果依次降低；三种sLNT增强鸡淋巴细胞增殖效果相比,sLNT2组A570值在同一浓度下多显著高于sLNT1和sLNT3组,表明sLNT2的效果最佳。试验V硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗免疫效果的影响为了比较3种硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗的免疫增强作用,免疫应答试验取14日龄雏鸡450只随机均分为9组,用新城疫Ⅳ系苗免疫,28日龄二免。在首免同时,6个硫酸化香菇多糖(sLNT)组和2个香菇多糖(LNT)组分别肌肉注射高、低剂量的sLNT1、sLNT2、sLNT3和LNT。分别于首免前和首免后6周内检测血清HI抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的变化。免疫保护试验取350只14日龄雏鸡随机均分为7组,除非免疫(NV)组外用新城疫Ⅳ系苗免疫,同时3个sLNT组和LNT组肌肉注射8.0 mg·mL-1的sLNT1、sLNT2、sLNT3和LNT 0.5mL,其它组注射等量生理盐水。于免疫后第21 d,除无佐剂组2(NA2)外各组鸡肌肉注射NDV强毒攻毒。分别于攻毒前和攻毒后第3、6、9、12和15 d测定血清HI抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的变化。结果显示,3种sLNT比LNT更显著提高血清抗体效价,高剂量效果优于低剂量；促进淋巴细胞增殖,低剂量的效果强于高剂量；3种sLNT能显著降低攻毒鸡发病率、死亡率和提高攻毒保护率,加速攻毒后血清抗体生成和T淋巴细胞增殖。综合评价以sLNT2效果最好。试验Ⅵ硫酸化香菇多糖对法氏囊疫苗免疫效果的影响为了比较3种硫酸化香菇多糖对法氏囊疫苗的免疫增强作用,14日龄雏鸡450只随机均分为9组,6个sLNT组分别肌肉注射高、低剂量的sLNT1、sLNT2、sLNT3,2个LNT对照组注射高、低剂量的LNT,无佐剂对照组(non-adjuvant, NA)注射等量生理盐水。在给药后4天用法氏囊疫苗免疫,两周后进行二免。分别于首免前和首免后第7、14、21、28和35d采血,检测血清抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的变化。取脾脏、法氏囊和胸腺测定免疫器官指数。结果表明,3种sLNT均能显著提高血清抗体效价、促进T淋巴细胞增殖和免疫器官发育,作用强于未修饰的LNT,并有一定的量效和时效关系,高剂量提高血清抗体效价、低剂量促进T淋巴细胞增殖的效果较好,综合评价以sLNT2的效果最好。试验Ⅶ五种硫酸化多糖增强CEF抵抗和清除NDV感染的比较为了筛选抗病毒作用较好的硫酸化多糖,比较了sLNT2和本实验室前期筛选出的硫酸化黄芪多糖sAPS60、硫酸化淫羊藿多糖sEPS5、硫酸化当归多糖sCAPS11和硫酸化枸杞多糖sLBP14的体外抗病毒作用。首先测定5种硫酸化多糖对CEF的安全浓度,然后用MTT法比较了它们对CEF抵抗鸡新城疫病毒(NDV)感染能力的影响,用实时荧光PCR方法检测CEF培养体系中NDV含量的变化。结果显示,5种硫酸化多糖均可增强CEF抵抗和清除NDV感染的能力,其强弱顺序依次为sEPS5>sAPS60>sLMT2>sLBP14、sCAPS11、sEPS5、sAPS60和sLNT2的效果较好。试验Ⅷ五种硫酸化多糖促进鸡淋巴细胞增殖、IL-2和IL-6分泌的比较为了筛选增强免疫作用较好的硫酸化多糖,比较了sLNT2、sAPS60、sEPS5、sCAPS11和sLBP14的体外增强免疫作用。首先测定5种硫酸化多糖对鸡外周血淋巴细胞的安全浓度,然后将5种硫酸化多糖分别单独或与ConA一起加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化,用ELISA方法测定淋巴细胞上清中IL-2和IL-6含量。结果表明,5种硫酸化多糖均可单独或协同ConA刺激淋巴细胞增殖,作用由强到弱的顺序为sAPS60>sEPS5>sCAPS11>sLBPM14、sLNT2,且有一定的浓度依赖关系；5种硫酸化多糖均可协同ConA刺激淋巴细胞分泌IL-2和IL-6,以sAPS60和sEPS5效果较好。试验Ⅸ三种硫酸化多糖增强ND疫苗免疫效果的比较为了进一步筛选增强免疫作用较好的硫酸化多糖,14日雏鸡175羽随机分为5组,除空白对照组外用NDV-Ⅳ系苗免疫,28日龄二免。在首次免疫的同时,3个硫酸化多糖组分别一次皮下注射sAPS60、sEPS5和sLNT2,无佐剂对照组注射等量生理盐水。分别于首次免疫前和首次免疫后第7、14和21d每组随机抽取6羽翼下静脉采血,测定ND抗体效价；在第14和21d每组随机抽取4羽心脏采血,测定外周血淋巴细胞增殖及其分泌IL-2和IL-6的变化。于首次免疫后第23 d,除空白对照组外用NDV强毒攻毒,每天观察鸡群发病、死亡情况,连续观察14 d统计发病率、死亡率和免疫保护率。结果表明,3种硫酸化多糖能显著提高新城疫抗体效价,促进淋巴细胞增殖及其IL-2和IL-6的分泌,明显提高攻毒保护,sAPS60、sEPS5的效果优于sLNT2。