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猪繁殖与呼吸系统综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的高度接触性传染病。PRRSV作为一种全世界范围内可导致猪发病的重要致病原,不同性别、年龄阶段和品种的猪均可被感染,临床上可引起仔猪呼吸道疾病、妊娠母猪早产、流产和木乃伊胎等症状。当前商品化的PRRSV灭活疫苗与减毒活疫苗可提供的保护作用十分有限,中和抗体和细胞介导的免疫反应产生较弱,且疫苗毒株很有可能在田间传播并存在毒力反强的风险,无法为PRRSV的防控提供充足的条件。本研究从广西省某猪场采集疑似PRRSV感染的病料样本中进行病毒分离,并通过RT-PCR、细胞病变效应（CPE）与间接免疫荧光（IFA）等方式验证了病毒分离成功。进一步对其全基因组序列分段扩增后连接,将Nsp2与GP5等序列分别与参考毒株进行对比,分析该分离株（17-10-PI）的遗传进化关系。随后将分离株接种于试验仔猪,观察其临床表现、体温变化和存活率,并进行病毒血症与细胞因子检测和病理组织学分析,确定分离株的致病性。根据近年来我国PRRS疫情的防控形势,成功构建重组腺病毒候选疫苗,并通过动物试验对其免疫原性和保护性进行评价,可为PRRS新型疫苗的研发提供参考依据。1.JXA1-like谱系毒株分离鉴定及基因组遗传变异分析将病毒液接种至Marc-145细胞后出现了明显的CPE,并通过RT-PCR和IFA等分子生物学鉴定,证实17-10-PI株分离成功。分离株基因组全长为15320 bp（除去polyA尾）,包括189bp的5’-UTR和149bp的3’-UTR。同源性分析结果表明:17-10-PI株与JXA1株的全基因组同源性为98.8%,GP5和Nsp2同源性为99.2%和99.0%;与美洲型VR-2332株和欧洲型Lelystad virus（LV）株同源性分别为88.9%和57.8%;属于HP-PRRSV JXA1-like谱系毒株。2.分离株17-10-PI致病性研究分离株动物回归实验中攻毒组试验仔猪出现典型的病毒感染症状,攻毒后6～10 dpi体温持续高于40.0℃,9 dpi时达到峰值40.8℃,1 5 dpi时有1头试验仔猪死亡。试验组与对照组仔猪平均日增重分别为0.266 kg和0.423 kg,差异非常显著（P<0.01）。17-10-PI株能在试验仔猪体内快速复制引起病毒血症,感染后3 dpi开始至试验结束均可在全血中检测到PRRSV核酸,11 dpi达到峰值。相关细胞因子不同程度升高,以IFN-α和IL-2升高更为显著。剖检和病理学检查显示,17-10-PI株可致明显的间质增生性肺炎和炎性细胞大量浸润等病理损伤。3.重组腺病毒候选疫苗的构建及小鼠免疫评价设计并合成了含有特征性PRRSV表位的嵌合抗原基因con-maj or（包括NADC30-like和JXA1-like的T细胞表位）,成功构建了表达NADC30-like谱系PRRSV 的 GP5 表位（pac-Ad5-30-GP5）和表达嵌合表位（pac-Ad5-con-major）的重组腺病毒载体候选疫苗。小鼠免疫原性试验结果显示:与商品苗免疫组相比,免疫后35 d时pac-Ad5-con-major和pac-Ad5-30-GP5试验组能显著提高血清中GP5特异性抗体水平（P<0.05）;35d时,相比PBS对照组（60.13pg/mL）,重组腺病毒免疫组（pac-Ad5-con-major:85.12pg/mL;pac-Ad5-30-GP5:86.61 pg/mL）能显著提高IL-4的表达量（P<0.05）,pac-Ad5-con-major免疫组能诱导相对较高水平的IFN-y（506.49 pg/mL）,显著优于商品苗免疫组（330.00 pg/mL）（P<0.05）;PRRSV特异性刺激后,pac-Ad5-con-major免疫组SI指数（2.17）相比其他免疫组（pac-Ad5-30-GP5:1.82;商品苗:1.78）优势更为明显（P<0.05）。4.重组腺病毒候选疫苗猪体免疫评价猪体免疫原性试验结果显示:pac-Ad5-con-major免疫组特异性抗体水平于免疫后35 d达到峰值,高于其他免疫组,并于免疫后14 d～35 d持续显著高于其他免疫组（P<0.05）;免疫后35 d,重组腺病毒免疫组特异性中和抗体滴度（pac-Ad5-con-major:17.78±6.96;pac-Ad5-30-GP5:16.10±2.23）达到峰值;35 d时,重组腺病毒免疫组IL-4的表达量（pac-Ad5-con-major:52.97 pg/mL;pac-Ad5-30-GP5:55.49 pg/mL）均高于商品苗免疫组（50.29 pg/mL）;相比商品苗免疫组（214.60 pg/mL）,重组腺病毒免疫组均可显著诱导较高水平的IFN-γ（pac-Ad5-con-major:253.33 pg/mL;pac-Ad5-30-GP5:254.69pg/mL）（P<0.05）;PRRSV特异性刺激后,相比PBS对照组（1.42）,重组腺病毒pac-Ad5-con-major免疫组（2.60）能极显著的提高SI指数（P<0.001）,同时高于pac-Ad5-30-GP5（2.11）和商品苗（2.45）免疫组。5.重组腺病毒候选疫苗猪体攻毒保护试验试验仔猪攻毒（NADC30-like株）后,PBS组体温在5 d后达到峰值（40.64℃）,攻毒后2～9 d体温均高于40℃。各免疫组（pac-Ad5-30-GP5试验组、pac-Ad5-con-major试验组和商品苗对照组）在攻毒5d后体温开始逐渐降低趋于正常,各天体温均低于40.0℃。与PBS组相比,重组腺病毒免疫组能非常显著的降低试验仔猪血液病毒载量（pac-Ad5-con-major:24.95 倍,P<0.01;pac-Ad5-30-GP5:16.36倍,P<0.01）。pac-Ad5-con-major 免疫组对肺脏（5.88 倍）和肝脏（5.94倍）组织的病毒载量的降低程度显著高于商品化疫苗组（P<0.05）,腹股沟淋巴结等组织器官的病毒拷贝数也存在不同程度的降低。病理切片结果显示:PBS对照组可见支气管周围有较多淋巴细胞浸润,少量细胞坏死,肺间质增生明显,有大量肺泡腔扩张等。pac-Ad5-con-major、pac-Ad5-30-GP5和商品苗试验组肺脏病理切片局部可见肺泡壁增厚,伴有少量淋巴细胞浸润。综上,本试验成功分离一株PRRSV JXA1-like谱系毒株（17-10-PI株）,该分离株可引起试验仔猪较为严重的临床症状和病理变化,属于高致病性PRRSV;成功构建重组腺病毒pac-Ad5-30-GP5和pac-Ad5-con-major候选疫苗;重组腺病毒候选疫苗能诱导试验小鼠和猪体产生特异性体液和细胞免疫应答,部分免疫指标优于商品疫苗,可以在一定程度上保护猪体免受PRRSV攻击。