皮肤T细胞淋巴瘤（cutaneousT cell lymphoma,CTCL）是一组异质性的T淋巴细胞来源的淋巴瘤,属于结外非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin’slymphoma,NHL）。其中,蕈样肉芽肿（mycosisfungoides,MF）和 Sezary 综合征（sezary syndrome,SS）是其中最常见的两种亚型。最新的流行病学调查显示其发病率逐年上升,在许多国家已成为威胁公众健康的重要问题。其发病的确切机制尚不明确,与多种因素相关,且近来越来越多的研究证据表明,凋亡抵抗与MF和SS的发展密切相关。CTCL的治疗主要依据其分期,对于早期局限者,多采用局部用药或物理治疗,而进展期或难治性的患者往往需要采用全身系统治疗或联合治疗,目前尚无完全治愈的方法。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors,HDACi）是一种非细胞毒的新型肿瘤靶向治疗药物,在体内外均表现出较强的抗肿瘤作用。目前已有两种HDACi被美国食品药品监督管理局（food and drug administration,FDA）批准用于难治性或复发性的CTCL,即伏立诺他（vorinostat）和罗米地辛（romidepsin）。但由于其应答率较低、药物抵抗等问题,在一定程度上制约了其临床应用,所以寻找能够帮助其增强应答率,提高药效,延缓或逆转其治疗抵抗的联合治疗方法或药物显得非常重要。抗肿瘤中药因其多环节、多靶点影响肿瘤的发生、侵袭、转移的特点,逐渐成为近年来抗肿瘤药物研发的热点,且临床上常以其作为抗肿瘤治疗的辅助用药。中药单体通常是指中药中具有明确化学结构的活性成分,其中有些中药单体具有明显的抗肿瘤活性,如姜黄素（Curcumin）、槲皮素（Quercetin）、大黄素（Emodin）、淫羊藿素（Icaritin）、白藜芦醇（Resveratrol）和熊果酸（Ursolic acid）等。此外,部分中药单体还可与现有抗肿瘤药物联合使用而发挥协同抗增殖和促凋亡等效应。本研究具体内容包括以下五个部分:第一部分 抗皮肤T细胞淋巴瘤中药单体的筛选目的:以细胞增殖为筛选模型,考察六种抗肿瘤中药单体（槲皮素、大黄素、淫羊藿素、白藜芦醇、姜黄素、熊果酸）对三种CTCL细胞（Myla细胞、Hut-78细胞、HH细胞）增殖的影响,筛选出药效最佳的中药单体,作为后续伏立诺他联合用药的目标中药单体。方法:将三种CTCL细胞分别用10μM、20μM、40μM浓度的六种中药单体作用72h后,采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测其OD值并换算细胞活力百分比,评估六种中药单体对CTCL细胞增殖的影响。结果:Myla细胞中,白藜芦醇与熊果酸20μM处理的细胞活力低于50%,其余四种药物40μM处理的细胞活力也均低于50%。Hut-78细胞中,姜黄素、白藜芦醇、淫羊藿素、熊果酸20μM处理的细胞活力均低于50%,槲皮素40μM处理的细胞活力也低于50%,但大黄素40uM处理后细胞活力仍高于50%。HH细胞中,姜黄素、白藜芦醇、熊果酸20μM处理的细胞活力均低于50%,而其余三种药物40μM处理的细胞活力均仍高于50%。三种CTCL细胞在熊果酸处理后的细胞活力下降程度最大,其下降比例大于其他五种中药单体。结论:六种中药单体在设定浓度下对三种CTCL细胞均可发挥一定程度的增殖抑制作用,熊果酸对CTCL细胞的增殖抑制作用强于其他五种中药单体,熊果酸可作为后续伏立诺他联合用药的目标中药单体。第二部分 熊果酸联合伏立诺他的药效研究目的:评估熊果酸联合伏立诺他对CTCL细胞增殖和凋亡的影响。方法:（1）将Myla细胞和Hut-78细胞分别使用梯度浓度（100μM、40μM、20μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM）的熊果酸处理24h、48h、72h后,采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测其OD值并换算增殖抑制率和计算IC50,以摸索联合药物作用的适宜浓度。依据上述结果,将Myla细胞和Hut-78细胞使用熊果酸和伏立诺他联合作用48h后,换算细胞活力百分比并计算CI值,以明确两种药物的联合效应（相加、协同或拮抗）。（2）将Myla细胞和Hut-78细胞分别使用10μM、15μM、20μM处理24h后,采用流式细胞术检测其凋亡率。接着联合使用10μM的熊果酸和2/1μM的伏立诺他处理Myla细胞和Hut-78细胞48h,采用流式细胞术和Western Blotting检测其凋亡率和凋亡相关蛋白的表达量。结果:（1）熊果酸处理Myla细胞24h、48h、72h的IC50分别为34.67±7.56μM、16.22±4.09μM、14.45±1.71μM,熊果酸处理 Hut-78 细胞 24h、48h、72h 的 IC50 分别为22.91±3.24μM、16.22±1.59μM、7.76±0.99μM。熊果酸联合伏立诺他处理的CTCL细胞的细胞活力低于两个单药组,两种药物在Myla细胞和Hut细胞中的CI值分别为0.334和0.498（0.3≤CI<0.7为协同作用）。（2）熊果酸处理后对照组、10μM组、15μM组、20μM组的Myla细胞的总凋亡率（早期凋亡+晚期凋亡）依次为2.78%、3.30%、44.76%、69.74,Hut-78 细胞的总凋亡率依次为 11.29%、20.39%、65.01%、85.29%。联合药物作用时,联合组的总凋亡率高于单药组,且将各实验组的总凋亡率分别减去对应对照组的总凋亡率后,联合组的总凋亡率高于单药组。Western Blotting的结果显示Myla细胞中,联合组的Bcl-2明显下调,低于单药组,而联合组的Bax、Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP均上调表达,高于单药组,Hut-78细胞中以上变化不显著。结论:熊果酸与伏立诺他之间在CTCL细胞的增殖抑制和促凋亡方面存在协同效应。第三部分 熊果酸及伏立诺他作用皮肤T细胞淋巴瘤的转录组测序分析目的:应用转录组测序技术进行熊果酸和伏立诺他抗增殖及促凋亡的分子机制探索。方法:（1）将经过10μM熊果酸处理48h的Myla细胞和对照组细胞进行转录组测序及数据分析,并通过RT-qPCR和Western Blotting对发现的关键基因和蛋白进行表达量验证。（2）将Myla细胞使用10μM熊果酸和2μM伏立诺他分别单独和联合处理48h后,与对照组细胞一同进行转录组测序及数据分析,并通过RT-qPCR和Western Blotting对发现的关键基因和蛋白进行表达量验证。结果:（1）通过转录组测序,我们共获得2466个显著差异表达基因,进一步通过信息学分析,我们发现了诸多与细胞增殖和凋亡相关的信号通路（TNF-α信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、MAPK信号通路和RIG-I样受体信号通路）和一些关键节点蛋白（NF-κB家族相关蛋白、蛋白酶体、TNF家族蛋白等）。通过基因和蛋白水平的验证,这些通路中的关键分子和蛋白互作的关键节点蛋白的表达量变化与测序结果基本一致。（2）通过转录组测序及数据分析,我们选取了 24中基因和5种蛋白进行了基因和蛋白水平的验证,结果与测序结果基本一致。其中伏立诺他对CKMT1A具有上调表达作用,而熊果酸对CKMT1A具有下调表达作用。结论:熊果酸显著抑制CTCL细胞增殖及促进凋亡,可能是TNF-α、NLRP1、JNK、MDA5等多种分子蛋白和信号通路相互作用的结果。另外,伏立诺他可增强CTCL细胞中CKMT1A的表达,而熊果酸对CKMT1A具有下调表达作用,提示CKMT1A可能是两者发挥协同抗CTCL作用的潜在靶点。第四部分 CKMT1A在熊果酸协同伏立诺他抗皮肤T细胞淋巴瘤中的作用研究目的:探究CKMT1A在熊果酸协同伏立诺他抗皮肤T细胞淋巴瘤中的作用。方法:（1）采用Western Blotting进一步考察伏立诺他作用不同时间（0h、24h、48h、72h）和不同浓度的伏立诺他（0μM、0.5μM、1μM、2μM）作用Myla细胞后,CKMT1A的蛋白表达水平变化,伏立诺他对不同CTCL细胞（Myla细胞、Hut-78细胞、HH细胞）的CKMT1A蛋白表达水平的影响以及不同HDACi（伏立诺他、罗米地辛、贝利司他和帕比司他）对Myla细胞CKMT1A蛋白表达水平的影响。（2）使用CKMT1A底物（肌酸）及底物类似物（环肌酸）考察CKMT1A对细胞增殖（细胞增殖实验）的影响。构建及鉴定慢病毒介导CKMT1A基因沉默细胞株,并考察CKMT1A基因沉默后伏立诺他在CTCL细胞中的促凋亡（流式）效应的变化。（3）通过分子对接技术分析熊果酸与CKMT1A的直接相互作用。结果:（1）不同浓度、时间的伏立诺他作用后,My1a细胞中的CKMT1A的蛋白质表达水平均有所提高,且这种上调CKMT1A蛋白表达的作用在其他多种HDACi中均有体现,除HH细胞外,伏立诺他对Myla细胞和Hut-78具有促CKMT1A蛋白表达的作用。（2）CKMT1A的表达量变化可影响其底物产物磷酸肌酸的含量,增加底物肌酸或底物类似物环肌酸,并不能影响其底物产物的含量,从而对细胞增殖无影响。在成功构建的稳转CKMT1A沉默细胞株中,仅CKMT1A的沉默表达对细胞凋亡没有影响,而使用伏立诺他刺激后,凋亡率相较于对照组有显著性的增加。（3）CKMT1A与熊果酸形成了 3个氢键,分子对接打分（结合能）为-7kcal/mol,熊果酸与CKMT1A具有较强的结合活性。结论:伏立诺他诱导的CKMT1A的高表达一定程度上影响了伏立诺他在CTCL细胞中抗肿瘤效应的发挥,而熊果酸对CKMT1A的下调表达作用可能是其与伏立诺他协同抗CTCL的分子机制之一。熊果酸与CKMT1A具有较强的结合活性,提示熊果酸可与CKMT1A之间发生直接相互作用,从而可能影响了 CKMT1A的表达或其功能。CKMT1A可能是熊果酸协同伏立诺他抗CTCL的靶点之一。第五部分 分子对接技术在广谱抗增殖药物中的延伸初探目的:初步探索广谱抗增殖药物与CKMT1A的直接相互作用,为以后能否选择CKMT1A作为抗增殖药物协同作用靶位进行系统研究做铺垫。方法:（1）将多种异常增殖疾病（黑色素瘤、胃癌、鳞癌、组织细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、银屑病）的代表细胞（A375、M14、SGC-7901、SCC-9、U937、Myla、Hut-78、HaCat）与阿达帕林作用72h后,采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测其OD值并换算增殖抑制率。（2）通过分子对接技术分析阿达帕林与CKMT1A的直接相互作用。结果:（1）上述细胞在阿达帕林处理后均表现出不同程度的增殖抑制,且这种增殖抑制呈浓度依赖性。各细胞72h阿达帕林的IC50分别为3.95±0.19μM（A375）、1.89±0.22μM（M14）、9.67±1.53μM（SGC-7901）、7.62±0.72μM（SCC-9）、7.17±1.37μM（U937）、19.48±4.55μM（Myla）、0.72±0.26μM（Hut-78）、2.21±0.35uMμM（HaCat）。（2）分子对接技术分析表明,阿达帕林与CKMT1A形成了 4个氢键,分子对接打分（结合能）为-7.3kcal/mol。结论:阿达帕林对异常增殖疾病来源的代表细胞（包括CTCL细胞）具有广泛的增殖抑制作用,且与CKMT1A具有较强的结合活性,提示CKMT1A可能会成为某些抗增殖药物发挥协同作用的靶位。