论文部分内容阅读
中药复方是中医临床用药的基本形式,是中医辨证论治理论精髓的具体体现。复方四君子汤出自宋代《太平惠民和剂局方》,由人参、白术、茯苓以及甘草四味药物组成,主治脾气虚证。前期研究表明四君子汤的功效不完全依赖于小分子类化合物,其调节免疫的作用可能与含量较高的水溶性多糖相关。研究显示,复方多糖对损伤免疫系统具有不同程度恢复功能,特别是与肠粘膜免疫直接相关。为了进一步探讨四君子汤免疫调节作用的物质基础,本文首先对四君子汤组成单味药的白术多糖进行了考察,在此基础上开展四君子汤复方多糖的系列研究,采用免疫-肠道微生物-代谢物“三联效应”指标法筛选活性多糖组分,对活性组分进行进一步纯化获得均一活性多糖,并进行结构表征、模拟人胃肠道代谢研究,探索四君子汤均一活性多糖的体外代谢过程及对肠道菌群的调节作用,为四君子汤体内药效物质基础探讨提供依据。1.白术水煎液中分离得到均一白术多糖,发现白术多糖在改善脾虚大鼠证状的同时,对脾虚证大鼠肠道菌群结构（ERIC-PCR图谱法）具有明显的恢复作用,利于恢复肠道菌平衡。从白术水煎液中分离纯化获得均一白术多糖（PAM）,其单糖组成及摩尔比是鼠李糖:木糖:葡萄糖:甘露糖:半乳糖=0.03:0.25:0.15:0.41:0.15,红外检测显示400-4000cm-1具有多糖特征吸收峰,原子力显微镜观察表观形貌发现多糖糖链是曲折盘绕而呈球状分布;多个球状多糖互相聚拢,分子间存在相互作用力。PAM能够在胃肠液中产生还原糖,同时改善番泻叶致脾虚模型大鼠的肠道菌群紊乱的现象。2.从四君子汤水煎液中分离纯化获得四君子汤多糖的主要组分,明确三个主要多糖组分理化性质。四君子汤汤剂经提取分离,粗糖得率1.2%。通过离子交换柱层析获得三个多糖组分S-1,S-2,S-3,得率分别是36.5%,11.9%,20.9%。三个组分总糖含量分别是99.0%,87.5%和67.5%,糖醛酸含量为0.5%,1.7%和10%,蛋白含量为0.2%,3.4%和11.2%。三个多糖组分均为杂多糖,单糖组成和摩尔比分别是S-1为Ara:Man:Glc:Gal=0.8:4.4:93.1:1.6,S-2由五种单糖组成,摩尔比为Rha:Ara:Man:Glc:Gal=1.4:5.3:1.6:83.5:8.1,S-3多糖组分由六种单糖组成,摩尔比为Rha:Ara:Xyl:Man:Glc:Gal=7.3:10.1:2.6:5.2:55.6:19.1。3.基于免疫-肠道微生物-代谢物“三联效应”指标筛选四君子汤多糖活性组分,其中S-3组分对利血平引起的脾虚证状具有显著改善作用。采用利血平致脾虚大鼠模型,以免疫、肠道菌和肠道微生物代谢物（短链脂肪酸）为综合指标,考察四君子汤多糖组分对模型大鼠的影响,结果显示S-3组分能够改善肠道菌群的结构,升高利血平造模后的短链脂肪酸乙酸和丁酸的含量,同时可以增强肠道免疫功能,提高CD4+/CD8+比值,缓解肠道炎症的产生,减少炎症因子IL-2和IFN-γ分泌,使肠道维持正常的状态。4.活性组分S-3经分离纯化获得均一多糖并结构表征,体外活性验证发现均一多糖具有免疫活性。采用响应面法优化S-3制备工艺,其得率可达24.9%。对S-3进行分子筛柱层析制备,获得均一性良好的水溶性多糖S-3-1和S-3-2。抗补体实验证明S-3-1具有免疫活性。进一步考察发现S-3-1对巨噬细胞RAW264.7不具有细胞毒性,并且高浓度S-3-1能够促进巨噬细胞NO和TNF-α分泌。对活性均一多糖S-3-1进行结构表征发现,均一多糖S-3-1分子量为13.5×104Da,单糖组成Rha,Ara,Xyl,Man,Glc,Gal=0.35:0.37:1.4:0.31:3:0.8,总糖含量99.64%,未检测到蛋白,含有少量糖醛酸1.03%,高碘酸氧化和Smith降解结果为Glycerol:Erythritol:Mannose:Galactose=5.57:0.82:0.60:0.28,甲基化以及核磁结果显示S-3-1是以Rha,Glc,Xyl为末端连连,1→3,6 Man和1→4,6 Gal为支链,主链结构为1→6 Gal,1→4Glc和1→2 Man。原子力显微镜（AFM）观察S-3-1不同浓度下的表观形貌存在差异。通过结构表征及免疫活性研究,S-3-1为具有抗补体及调节巨噬细胞免疫活性的四君子汤复方均一多糖。5.四君子汤均一活性多糖S-3-1体外胃肠代谢及对肠道菌群的作用研究发现,均一多糖在人工胃肠液中均有代谢,同时人源肠道菌厌氧孵育结果表明,多糖影响菌群短链脂肪酸的代谢,降低孵育液pH,促进孵育液中有益菌的生长繁殖。采用DNS法检测多糖S-3-1在人工胃液及人工肠液中变化,结果显示还原糖的含量随着孵育时间的延长而增多,孵育时间2 h时,达到稳定状态,说明多糖在人工胃液及肠液中均有还原糖产生。采用16S rDNA DGGE-PCR技术及illumina高通量测序技术检测S-3-1多糖对菌群结构的影响,采用GC法检测肠道微生物短链脂肪酸的代谢变化,pH计测定肠道微生物代谢物引起的孵育液酸碱度变化。结果显示,预先经过胃肠液孵育再经肠道菌液孵育的多糖能促进肠道菌代谢乙酸,降低肠道的pH值,维持肠道酸性环境。通过肠道菌群结构研究发现,经过胃液和肠液的消化后的多糖较原型多糖,能够增加肠道有益菌（如柔嫩梭菌属,双歧杆菌属,巨单胞菌属和毛螺菌属）的生长繁殖,提高乙酸,丙酸,丁酸短链脂肪酸水平,改善了肠道的酸性环境。因此推测多糖增强肠道免疫功能,可能与促进肠道有益菌生长以及分泌丁酸等短链脂肪酸有关。