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原发性肝癌(Primary liver Cancer,PLC)是目前全球性的重大健康问题之一,死亡率高,在我国乃至全球范围都是非常常见的恶性肿瘤之一,在我国肿瘤致死病因方面排名已经高居第二位。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌的最常见的类型。我国HCC发病因素主要和乙型肝炎病毒等相关,肝炎的不良转归包括肝硬化、肝癌,但是肝癌的起病比较隐匿,发现时患者已多为中晚期。全球每年大约有50.5%新发患者、51.4%癌症相关的患者死亡发生在中国。当前被广泛使用的肝癌诊断标志物是甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP),但是它在一些肝脏良性疾病中也会升高,不能满足临床肝癌诊断的需求。糖基化是对蛋白质的一种重要修饰,有着调节蛋白质功能作用。在人类多种疾病比如:肿瘤、免疫性疾病等的发生发展过程中伴随有蛋白质糖基化的异常修饰。近年来,糖组学的研究备受关注,国内外研究包括本实验室采用包括质谱、毛细管电泳等糖基化研究技术从糖基化水平寻找了肝癌、肝硬化的差异蛋白,采用基于基质辅助激光解吸电离-质谱(Matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry,MALDI-MS)的方法对不同肝病患者血清单个蛋白糖链结构进行了分析研究,探究其对肝癌的临床应用价值,揭示这些差异糖蛋白作为肝癌标志物有一定的应用前景。目前临床应用的肿瘤血清标志物大部分是糖蛋白,糖基化发生改变的糖蛋白已经开始应用于人类疾病的诊断及预后评估,如AFP和核心岩藻糖基化的AFP即甲胎蛋白异质体(Alpha-fetoprotein-L3,AFP-L3)。α2巨球蛋白(Alpha2 macroglobulin,AMG)是血浆中分子量最大的蛋白质,主要由肝细胞和单核-巨噬细胞系统合成。它的720KDa的四聚体结构在维持细胞因子和生长因子的稳态中发挥重要作用,其作为机体一种重要的急性时相反应蛋白,参与了机体多种疾病的病理生理。AMG可以被细胞内蛋白酶激活,激活的AMG与相应的细胞表面受体结合,作为许多信号通路的一种调节因子,参与细胞调控,在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。Poon等人的研究结果提示,肝癌组织中AMG的表达显著高于正常肝组织。葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78,GRP78)是AMG特异性结合的细胞表面受体。AMG与细胞表面GRP78结合可以促进表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor,EGFR)与非受体酪氨酸蛋白激酶(Cellularsarcoma kinase,c-Src)相互作用,在Y1101和Y845位点磷酸化EGFR,促进肝癌侵袭和转移。本课题在本实验室前期有关肝病N-糖标志物系列研究的基础上,聚焦血清中特定蛋白之一-AMG为研究靶分子,探讨AMG在肝癌发生发展中的改变,阐述其血清水平改变与肝癌发生发展的相关性,并在此基础上,采用能与核心岩藻糖特异性结合的小扁豆凝集素(Lens culinaris agglutinin,LCA),建立核心岩藻糖基化AMG(LCA-AMG)的检测方法检测异常糖基化修饰的特定蛋白。在临床水平研究其蛋白水平及其岩藻糖基化水平在慢性乙型肝炎(ChronichepatitisB,CHB)、肝硬化(Livercirrhosis,LC)及HCC中的改变和潜在临床诊断价值。第一部分:血清α2巨球蛋白在肝细胞癌中的临床诊断研究本研究分析HCC、LC和CHB的血清AMG水平并评价其临床意义。收集HCC患者402例,非HCC肝病患者151例(包括LC患者135例和CHB患者16例),使用免疫散射比浊法检测各病例组的AMG血清水平,HCC、LC和CHB组血清AMG水平分别为2.32(1.90,2.74)、2.02(1.66,2.48)、1.89(1.58,2.77)[中位数(25%百分位数,75%百分位数)](单位:g/L)。研究发现,相对于LC组,HCC组的血清AMG水平明显升高(P<0.001);HCC组和CHB组无显著统计学差异(P>0.05)。HCC组血清AMG水平明显高于疾病对照组(包括LC和CHB)且存在显著统计学差异[2.32(1.90,2.74)vs 1.98(1.65,2.48),P<0.001]。其中HCC患者AMG水平与多个临床指标如透明质酸(Haluronicacid,HA)、球蛋白(Globulin,GLB)、白蛋白(Albumin,ALB)、总蛋白(Totalprotein,TP)、谷氨酰转肽酶(Glutamyltranspeptidase,GGT)等存在一定相关性(P<0.05),其中AMG与HA(R=0.115,P=0.022)、GLB(R=0.235,P<0.001)、ALB(R=0.157,P=0.002)、TP(R=0.292,P<0.001)呈正相关,与实验室临床其他指标如GGT(R=-0.105,P=0.037)等呈负相关。AMG在HCC不同TNM分期及微血管侵犯(Microvascular invasion,MVI)间无明显差异。对于随访的肝细胞癌患者,通过生存曲线分析,发现在肝细胞癌患者中,血清中AMG高值组的肝细胞癌患者的无病存活率较低,生存率也较低(P<0.05)。第二部分核心岩藻糖基化α2巨球蛋白在肝细胞癌中的临床诊断研究本研究收集413例血清标本,其中包括193例HCC患者、104例LC患者、45例CHB患者及71例健康对照组(Healthycontrol,HC),用于分析探讨核心岩藻糖基化α2巨球蛋白从非HCC中鉴别诊断HCC的应用价值。LCA亲和层析柱与免疫散射比浊法相结合的方法进行血清核心岩藻糖基化α2巨球蛋白定量测定。研究结果发现:核心岩藻糖基化α2巨球蛋白(LCA-AMG),HCC、LC、CHB和HC组检测结果分别为:0.74(0.55,0.94)、0.56(0.42,0.72)、0.54(0.45,0.93)和0.35(0.28,0.44)[中位数(25%百分位数,75%百分位数)](单位:g/L),HCC组明显高于LC组和HC组,且具有明显统计学意义(P<0.001),HCC组和CHB组无明显统计学差异(P>0.05),LC组和CHB组均高于HC组(P<0.001);从非HCC(LC、CHB和HC)中鉴别HCC,ROC曲线下面积为0.751,95%可信区间:0.706～0.792。核心岩藻糖基化α2巨球蛋白/α2巨球蛋白×100(简称 LCA-AMG%),HCC、LC、CHB 和 HC组结果分别为31.25(26.61,35.42)、26.00(22.30,30.64)、26.23(23.86,31.89)、20.29(17.35,22.60)[中位数(25%百分位数,75%百分位数)],HCC组高于LC组,具有显著统计学意义(P<0.001),高于CHB组(P<0.01),也高于HC组(P<0.001);LC组和CHB组均高于HC组(P<0.001);从非HCC(LC、CHB和HC)中鉴别HCC,ROC曲线下面积为0.768,95%可信区间:0.725～0.808。HCC组血清LCA-AMG与临床部分检测指标具有一定相关性,与碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(Glutamyltranspeptidase,GGT)等呈负相关(R=-0.160,P=0.029;R=-0.214,P=0.003);血清LCA-AMG%与临床部分肝功能相关指标也具有一定相关性,如:和总胆红素(Total bilirubin,TBIL)、直接胆红素(Direct Bilirubin,DBIL)等呈正相关(R=0.157,P=0.030;R=0.148,P=0.041);与球蛋白(Globulin,GLB)、ALP、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)等呈负相关(R=-0.193,P=0.008;R=-0.151,P=0.040;R=-0.212,P=0.004);与谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、AFP、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、糖类抗原 199(Carbohydrateantigen199,CA199)、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)等无明显相关性。从非HCC中鉴别诊断HCC,使用logistics回归建立联合诊断模型:LogitAMG1=-5.102+0.462×AMG+0.140×LCA-AMG%,曲线下面积为0.776,95%可信区间:0.733～0.816。LogitAMG2=-4.025+0.007×AFP+0.163×LCA-AMG%-0.080×TBIL,曲线下面积为0.918,95%可信区间:0.887～0.943。LCA-AMG%在检测AFP阴性HCC中的诊断效率提示:LCA-AMG%曲线下面积为0.782,95%可信区间:0.726～0.832,敏感度为77.42%,特异度为71.36%。随着肿瘤直径的增加,血清LCA-AMG%有递减的趋势。血清LCA-AMG%在HCC不同AFP浓度、TNM分期、MVI分级及有无包膜间均无明显差异。本研究提示LCA-AMG%对于HCC以及AFP阴性HCC患者的鉴别诊断可能具有潜在的应用前景。