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【目的】
制备和鉴定类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)患者血清外泌体，并探究其对正常人外周血多形核细胞(Polymorphonuclear cell，PMNC)产生炎症因子的影响，以及其对Th1/Th17亚群的影响。并对RA患者血清外泌体进行miRNA组学测序分析，探讨其在RA发病中的可能机制。
【方法】
1．入组RA患者，并按照DAS28评分分为低活动度组(Lowdisease activity, LDA)、高活动度组(Highdiseaseactivity，HDA)；同时，招募健康人作为正常对照组(Health control，HC)。在HDA组中选出未用药的患者归为未用药高分组，在LDA组中选出未用药的患者归为未用药低分组。
2．采用差速超高速离心法分别分离制备RA患者和正常人的外泌体，利用透射电子显微镜、纳米粒子示踪分析仪与蛋白质免疫印迹法(WesternBlot，WB)分别对分离制备所得的外泌体进行鉴定。
3．将鉴定后的外泌体分别与正常人来源的PMNC共培养。蛋白芯片法检测共培养上清中的炎症因子谱；利用流式细胞仪(Flowcytometry,FCM)检测Th1和Th17亚群的比例变化。
4．未服药的RA患者血清来源的外泌体miRNA组学测序和分析
用Invitrogen试剂盒Trizol法抽提总RNA；使用NanoDropND-1000检测RNA纯度；利用IlluminaHiSeq4000测序仪上采用双端模式(PEmode)进行150cycle测序，建立CircRNA、LncRNA、MicroRNA及mRNA的表达谱。筛选出差异表达基因，对其进行GO基因功能富集分析及KEGG生物通路富集分析。
【结果】
1．入组案例基本资料及临床资料汇总，发现HDA组患者的DAS28评分、红细胞沉降率、疼痛关节数、肿胀关节数、C-反应蛋白定量等均显著高于LDA组，(P值均＜0.01)；HDA组、LDA组与HC组在性别、年龄等指标差异无显著性(P值均＞0.05)。
2．血清来源外泌体的分离及鉴定
(1)透射电子显微镜观察所得，HDA组源外泌体(HDA-Exos)、LDA组源外泌体(LDA-Exos)与HC组源外泌体(HC-Exos)均呈类圆形，外膜界限明显，可见典型“茶托样”结构，直径约为100nm。
(2)纳米粒子示踪分析仪检测结果显示各组外泌体样品粒径主要分布在30nm~150nm。
(3)WB检测结果显示三组外泌体均表达TSG101、CD63、CD81标志蛋白。
3．蛋白芯片法检测共培养上清中的炎症因子谱
(1)与Control组(正常人来源PMNC单独培养)比较，RA患者(LDA组和HDA组)源外泌体，在3个作用浓度，即1∶1(1mL全血来源的PMNC:1mL全血来源的外泌体)，1∶2(1mL全血来源的PMNC:2mL全血来源的外泌体)，1∶4(1mL全血来源的PMNC:4mL全血来源的外泌体)下共培养24h和48h后，均可显著诱导正常人PMNC产生更多的IL-4(P值均＜0.05)。
(2)与Control组比较，HDA组源外泌体，在3个作用浓度(1∶1，1∶2和1∶4)下共培养48h后，均可显著诱导正常人PMNC产生更多的IL-13(P值均＜0.05)。
4．流式细胞仪检测Th1和Th17亚群的比例变化
(1)与Control组比较，LDA组RA患者源外泌体在3个作用浓度(1∶1，1∶2和1∶4)下共培养48h，均可显著诱导正常人Th17亚群比例降低(均P＜0.05)；而与Control组比较，HDA组在1:4的作用浓度刺激下共培养48h后，可显著诱导正常人Th17细胞亚群比例下降P＜0.05)。
(2)FCM检测各组Th1亚群变化，各组别间差异无显著性(P＞0.05)。
5.筛选出差异表达的蛋白，并对其进行GO蛋白功能分析和KEGG通路分析(1)与HC组比较，LDA组RA患者源外泌体刺激正常人PMNC产生更多的IL-4和IL-13，其来源基因主要富集在酪氨酸磷酸化的STAT蛋白、细胞杀伤的负调控、内皮细胞凋亡过程的负调控等GO-BP条目以及细胞因子活性、细胞因子受体结合、生长因子受体结合等GO-MF条目，涉及IL-17信号通路、Th1/Th2细胞分化通路、T细胞受体信号通路等生物学过程。
(2)与HC组比较，HDA组RA患者源外泌体刺激正常人PMNC产生更多的IL-4、IL-13、IFN-γ和IL-1α，其来源基因主要富集在STAT蛋白酪氨酸磷酸化的正调控、神经炎症反应、JAK-STAT级联反应的正向调节等GO-BP条目以及细胞因子活性、细胞因子受体结合、受体配体活性等GO-MF条目，涉及IL-17信号通路、类风湿关节炎、Th1/Th2细胞分化通路、T细胞受体信号通路、哮喘等生物学过程。
6.未用药RA患者血清来源的外泌体microRNA转录组学测序和分析：
(1)未用药高分组与HC组共筛选出88个差异表达的miRNA，与HC组对比，未用药高度活动组上调的miRNA有14个，下调的miRNA有74个。
(2)未用药低分组与HC组共筛选出27个差异表达的miRNA，与HC组对比，未用药高度活动组上调的miRNA有13个，下调的miRNA有14个。
【结论】
RA患者血清外泌体可诱导正常人PMNC产IL-4和IL-13，以及下调Th17亚群比例。血清外泌体可参与调控机体炎症反应。
制备和鉴定类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)患者血清外泌体，并探究其对正常人外周血多形核细胞(Polymorphonuclear cell，PMNC)产生炎症因子的影响，以及其对Th1/Th17亚群的影响。并对RA患者血清外泌体进行miRNA组学测序分析，探讨其在RA发病中的可能机制。
【方法】
1．入组RA患者，并按照DAS28评分分为低活动度组(Lowdisease activity, LDA)、高活动度组(Highdiseaseactivity，HDA)；同时，招募健康人作为正常对照组(Health control，HC)。在HDA组中选出未用药的患者归为未用药高分组，在LDA组中选出未用药的患者归为未用药低分组。
2．采用差速超高速离心法分别分离制备RA患者和正常人的外泌体，利用透射电子显微镜、纳米粒子示踪分析仪与蛋白质免疫印迹法(WesternBlot，WB)分别对分离制备所得的外泌体进行鉴定。
3．将鉴定后的外泌体分别与正常人来源的PMNC共培养。蛋白芯片法检测共培养上清中的炎症因子谱；利用流式细胞仪(Flowcytometry,FCM)检测Th1和Th17亚群的比例变化。
4．未服药的RA患者血清来源的外泌体miRNA组学测序和分析
用Invitrogen试剂盒Trizol法抽提总RNA；使用NanoDropND-1000检测RNA纯度；利用IlluminaHiSeq4000测序仪上采用双端模式(PEmode)进行150cycle测序，建立CircRNA、LncRNA、MicroRNA及mRNA的表达谱。筛选出差异表达基因，对其进行GO基因功能富集分析及KEGG生物通路富集分析。
【结果】
1．入组案例基本资料及临床资料汇总，发现HDA组患者的DAS28评分、红细胞沉降率、疼痛关节数、肿胀关节数、C-反应蛋白定量等均显著高于LDA组，(P值均＜0.01)；HDA组、LDA组与HC组在性别、年龄等指标差异无显著性(P值均＞0.05)。
2．血清来源外泌体的分离及鉴定
(1)透射电子显微镜观察所得，HDA组源外泌体(HDA-Exos)、LDA组源外泌体(LDA-Exos)与HC组源外泌体(HC-Exos)均呈类圆形，外膜界限明显，可见典型“茶托样”结构，直径约为100nm。
(2)纳米粒子示踪分析仪检测结果显示各组外泌体样品粒径主要分布在30nm~150nm。
(3)WB检测结果显示三组外泌体均表达TSG101、CD63、CD81标志蛋白。
3．蛋白芯片法检测共培养上清中的炎症因子谱
(1)与Control组(正常人来源PMNC单独培养)比较，RA患者(LDA组和HDA组)源外泌体，在3个作用浓度，即1∶1(1mL全血来源的PMNC:1mL全血来源的外泌体)，1∶2(1mL全血来源的PMNC:2mL全血来源的外泌体)，1∶4(1mL全血来源的PMNC:4mL全血来源的外泌体)下共培养24h和48h后，均可显著诱导正常人PMNC产生更多的IL-4(P值均＜0.05)。
(2)与Control组比较，HDA组源外泌体，在3个作用浓度(1∶1，1∶2和1∶4)下共培养48h后，均可显著诱导正常人PMNC产生更多的IL-13(P值均＜0.05)。
4．流式细胞仪检测Th1和Th17亚群的比例变化
(1)与Control组比较，LDA组RA患者源外泌体在3个作用浓度(1∶1，1∶2和1∶4)下共培养48h，均可显著诱导正常人Th17亚群比例降低(均P＜0.05)；而与Control组比较，HDA组在1:4的作用浓度刺激下共培养48h后，可显著诱导正常人Th17细胞亚群比例下降P＜0.05)。
(2)FCM检测各组Th1亚群变化，各组别间差异无显著性(P＞0.05)。
5.筛选出差异表达的蛋白，并对其进行GO蛋白功能分析和KEGG通路分析(1)与HC组比较，LDA组RA患者源外泌体刺激正常人PMNC产生更多的IL-4和IL-13，其来源基因主要富集在酪氨酸磷酸化的STAT蛋白、细胞杀伤的负调控、内皮细胞凋亡过程的负调控等GO-BP条目以及细胞因子活性、细胞因子受体结合、生长因子受体结合等GO-MF条目，涉及IL-17信号通路、Th1/Th2细胞分化通路、T细胞受体信号通路等生物学过程。
(2)与HC组比较，HDA组RA患者源外泌体刺激正常人PMNC产生更多的IL-4、IL-13、IFN-γ和IL-1α，其来源基因主要富集在STAT蛋白酪氨酸磷酸化的正调控、神经炎症反应、JAK-STAT级联反应的正向调节等GO-BP条目以及细胞因子活性、细胞因子受体结合、受体配体活性等GO-MF条目，涉及IL-17信号通路、类风湿关节炎、Th1/Th2细胞分化通路、T细胞受体信号通路、哮喘等生物学过程。
6.未用药RA患者血清来源的外泌体microRNA转录组学测序和分析：
(1)未用药高分组与HC组共筛选出88个差异表达的miRNA，与HC组对比，未用药高度活动组上调的miRNA有14个，下调的miRNA有74个。
(2)未用药低分组与HC组共筛选出27个差异表达的miRNA，与HC组对比，未用药高度活动组上调的miRNA有13个，下调的miRNA有14个。
【结论】
RA患者血清外泌体可诱导正常人PMNC产IL-4和IL-13，以及下调Th17亚群比例。血清外泌体可参与调控机体炎症反应。