粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）是一种广泛分布于自然界中的革兰氏阴性菌,属于肠杆菌科沙雷氏菌属。粘质沙雷氏菌是部分脊椎动物和无脊椎动物的条件致病菌,可导致家蚕、奶牛、中华鳖等患病,更成为临床上感染越来越频繁的病原菌,可造成呼吸道感染、伤口感染、败血症等,逐渐成为医院的严重威胁。在蚕桑业中,粘质沙雷氏菌是家蚕的主要致病菌之一,感染家蚕后造成患败血症,在较短时间内可导致家蚕死亡,给蚕桑业带来了巨大的经济损失。不少研究显示Cpx AR双组分系统广泛存在于多种致病菌中,在细菌的致病性、生物膜的形成、耐药性等多方面发挥着重要的调控作用,但在粘质沙雷氏菌中鲜有报道,其功能尚不清楚。本文通过构建粘质沙雷氏菌SCQ1的cpx A、cpx R、cpx AR基因缺失菌株,并对基因敲除菌株进行相关生物学特性检测,研究Cpx AR双组分系统在粘质沙雷氏菌SCQ1中的调控功能,帮助我们进一步了解粘质沙雷氏菌的致病机制。主要研究结果如下:1.构建目标基因缺失菌株和回补菌株,利用同源重组置换策略构建缺失菌株。通过PCR以及基因测序筛选验证,成功获得了基因缺失菌株Δcpx A、Δcpx R、Δcpx AR及其回补菌株CΔcpx A、CΔcpx R、CΔcpx AR。2.根据相关生物学特性分析显示,与野生株SCQ1相比,单敲菌株Δcpx A的菌落形态、生长、蛋白酶以及卵磷脂酶水解活性、运动性、应激耐受性、抗生素耐受性、溶血活性均无明显变化,Δcpx A的菌膜形成能力在培养72 h之前,较SCQ1无显著差异,但在96 h时显著弱于SCQ1;单敲菌株Δcpx R的卵磷脂酶水解活性,蛋白酶水解活性,溶血活性,应激耐受性与SCQ1相比没有显著变化。当培养12 h时,Δcpx R菌落呈粉色,当培养至36 h时呈红色,与野生株表型基本一致,其生长速率略低于SCQ1,但最终细胞密度与野生型无差别。SCQ1泳动圈面积和群集运动圈面积分别是Δcpx R的2.04倍和1.375倍,Δcpx R的运动能力明显减弱。Δcpx R的生物膜形成能力明显弱于SCQ1。抗生素耐受性试验结果显示Δcpx R较SCQ1,头孢霉素、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星MIC值分别都升高了16倍、8倍、4倍、8倍,其他抗生素抗性均与SCQ1保持一致。3.双敲菌株Δcpx AR的生长速率明显低于野生菌株SCQ1,生长受到显著抑制。随着培养时间的延长,菌落由白色逐渐变为浅粉色。Δcpx AR的运动能力丧失,不表现溶血活性。Δcpx AR的蛋白酶水解能力,卵磷脂酶水解能力,生物膜形成能力明显减弱。Δcpx AR对5%KCl和0.05%SDS的耐受性无明显变化,对1%H2O2的耐受性减弱。抗生素耐受性结果表明,Δcpx AR与SCQ1相比,头孢霉素、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星、诺氟沙星、氧氟沙星MIC值分别增大了8倍、4倍、8倍、16倍,2倍,2倍,阿奇霉素、氯霉素MIC值降低了16倍,4倍。4.毒力试验结果显示,Δcpx A和Δcpx R对家蚕的致病性较野生株相似,而Δcpx AR的LD50是SCQ1的8.92倍,表明Δcpx AR对家蚕的致病性明显减弱。通过q RT-PCR检测了12个相关毒力基因的转录水平,结果显示,与野生株SCQ1相比,在Δcpx A和Δcpx R中shl A、Pho P、Pho Q均有明显上调,在Δcpx A中hfq与SCQ1相比,表达量明显降低,在Δcpx A以及Δcpx R中其他基因均有一定程度的上调或下调表达,但均无显著变化。shl B在缺失菌株Δcpx A、Δcpx R、Δcpx AR中几乎没有表达。与SCQ1相比较,在Δcpx AR中shl A有一定量的上调,Flh C、Flh D、hfq、Pho P、Pho Q、wec A均有显著性降低。初步结果显示,在突变株中部分毒力相关基因的转录水平有一定变化,这些变化是否由Cpx双组分系统调控还有待进一步深入研究。综上所述,在粘质沙雷氏菌SCQ1的Cpx AR双组分系统中,双基因敲除株Δcpx AR对粘质沙雷氏菌的生长、产胞外酶、运动性、应激耐受、生物被膜形成、耐药性和致病性的影响显著大于单基因敲除株Δcpx R及Δcpx A。