研究背景2型糖尿病（type2diabetes mellitus，T2DM）是一种常见内分泌代谢紊乱性疾病，随着社会进步与人民生活的富裕，发病率逐年增高，已成为当今世界威胁人类健康和生命的重大公共卫生问题之一。目前，T2DM发病的两个关键因素被认为是胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR）和胰岛β细胞功能减退，但至今仍未完全阐明T2DM的病因和发病机制。最近很多研究和大量报道证明，人体肥胖的同时，伴有炎症信号相关通路和细胞氧化应激的激活，并提出了氧化应激学说、炎症病因学说等相关学说。但目前尚不清楚引发细胞应激的真正原因。初步研究指出，氧化应激在其中占重要地位，其与IR和胰岛β细胞功能减退密切相关。虽然已经普遍认为，IR是T2DM的关键因素和环节，但氧化应激可能在IR发生中起着致因性作用；IR引起糖代谢紊乱早已成为“定论”，但氧化应激对糖代谢紊乱是否存在直接的相关性，尚不清楚。研究进展表明，葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）在动员糖代谢通路中发挥“开关”的调控作用，而涉及糖代谢、决定血糖水平的来源主要有3条路：①有氧代谢的三羧酸循环“主路”，早已为人们熟知；②乏氧时的磷酸戊糖的酵解副路，是运动后血糖代谢的主要形式，是主路的有效补充，虽然不需要氧分子但合成能量的效价比较低；③饥饿、糖供应缺乏时的糖异生支路，糖异生过程中的关键酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPKC）、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）。然而，在人们广泛关注氧化应激与IR损伤关系和代谢调控，却很少注意到氧化应激对糖来源和调控的影响，以及在血糖升高中“贡献”变化规律等分子机制。许多研究表明，IR与糖异生有关，但是，到底是“IR导致糖异生，还是糖异生导致IR？”至今没有定论。而氧化应激与IR发生有关，但对于糖异生到底有无影响？他们三者的调控作用关系如何？至今未见报道。噻唑烷二酮类（thiazolidinediones, TZDs）是PPARγ高度选择性的激动剂是对胰岛素抵抗靶组织的有效药物。能通过激活PPARγ的基因上调表达，改善胰岛K+、Ca2+通道、促进胰岛素分泌增加，加速了脂肪代谢，因而具有逆转IR的作用。但是，还无法说明活化PPARγ如何改善胰岛素敏感性这个关键问题。近年来发现一种脂肪细胞来源的多肽类激素，具有抵抗胰岛素的作用，被称为抵抗素（Resistin）。抵抗素的血浆水平可被增加胰岛素敏感性的药物罗格列酮或其他噻唑烷二酮类明显抑制，被认为可能是由PPARγ直接调控其表达引起的。同时，有研究指出腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）作为一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有改善IR的潜力，此外，AMPK还参与了机体胰岛素敏感性的调节。实验目的通过建立新型高脂高糖加氧化剂tBHP致大鼠胰岛素抵抗大鼠动物模型，观察糖脂代谢和关键靶分子PPARγ、Resistin、AMPK等指标的变化，研究胰岛素抵抗（IR）发生过程中，ROS与IR的调控关系；以及通过测定糖异生关键限速酶G6Pase、PEPCK等指标的变化，探讨ROS与IR相互作用过程中，是否存在糖异生的动员与调控，以及ROS对糖异生关键酶的作用机制。研究糖尿病，特别是2型糖尿病，发生、发展过程中“氧化应激-胰岛素抵抗-糖代谢失控”的相互作用关系。为阐明：氧化应激是致因，IR是关键，糖代谢失控是推手的“致病链”的调控分子机制，试图通过有效的抗氧化作用在这三个环节上阻断“致病链”的进行，为寻找新的治疗及预防方法提供实验依据。通过建立新型高脂高糖加氧化剂tBHP致大鼠胰岛素抵抗大鼠动物模型，研究胰岛素抵抗发生过程中ROS水平变化与及糖脂代谢的关系，基于氧化应激上ROS在改善IR过程中的关键作用及与糖异生的作用机制，为进一步认识PPARγ、Resistin、AMPK等IR相关分子在IR发生发展过程中的调控作用，以及阐明氧化应激-胰岛素抵抗-糖异生调控的初步机制，为寻找新的治疗及预防方法奠定基础。实验方法1. ROS诱导IR大鼠模型及相关调控机制的研究。通过以下研究，证明氧化应激是胰岛素抵抗产生的致因。①在高脂高糖饲料喂养的基础上，给大鼠注射小剂量tBHP，诱导大鼠产生IR。②测定实验动物血清、肝脏、脂肪组织的糖脂代谢及氧化应激相关指标，证明实验动物存在持续稳定的氧化应激损伤并加重IR。③测定IR大鼠肝脏中抗氧化相关的调控酶谱如，PPARγ、SOD1、Gpx1、CAT、GCLC、GR mRNA水平和蛋白的表达变化。④肝脏组织病理学检查，观察ROS及高脂高糖刺激下肝脏的形态和结构变化。2. ROS对糖代谢相关因子和IR调控的分子机制研究。在进一步研究氧化应激调控作用的基础上，测定PPARγ、Resistin、AMPK等分子的相互作用特点及与IR发生的关联性，证明胰岛素抵抗是糖尿病发生的核心，由于胰岛素抵抗造成血糖升高，糖代谢失控可能是关键，阐明其调控机制。①体外实验采用人正常肝细胞系QZG作为实验对象，研究不同浓度tBHP引起氧化应激对QZG细胞胰岛素信号影响的剂量效应关系。②在分离培养的细胞培养基中施加复合抗氧化剂，同时以TZDs为阳性对照组，观察氧化应激对细胞损伤的影响，以及抗氧化剂对细胞损伤的保护作用。③体内实验以建立的IR大鼠为研究基础，通过TZDs为对照治疗药物，腹腔注射AMPK抑制剂、抵抗素中和抗体，测定氧化应激、糖代谢项指标的变化及肝组织在IR下的相关因子的蛋白表达变化。初步研究PPARγ-Resistin-AMPK通路的相互关系以及脂代谢、脂毒性引起胰岛素抵抗的影响。④体外实验，使用western blot和RT-PCR等分子生物学技术，测定和观察tBHP对胰岛素刺激下Akt、AMPK磷酸化的变化，tBHP对胰岛素刺激下糖脂代谢相关因子蛋白表达的影响、不同增敏剂和抑制剂对葡萄糖+tBHP诱导IR的影响及对tBHP诱导IR中糖代谢及糖异生相关酶mRNA的影响。3.复合抗氧化剂阻断糖代谢失控及逆转IR的分子机制研究。在初步证明糖尿病发生过程中氧化应激是致因，IR是关键，糖代谢失控是推手的“致病链”基础上，探讨抗氧化对这三个重要节点的抑制作用，以期证明抗氧化改善胰岛素抵抗的分子机制。①体外实验通过肝微粒体过氧化模型首先筛选合适剂量的复合抗氧化剂，以QZG细胞为研究对象，观察经典降糖药及复合抗氧化剂对氧化应激诱导的肝细胞糖异生相关因子及胰岛素信号传导的影响、对氧化应激诱导IR的逆转作用的影响。②通过建立STZ诱导的糖尿病模型，观察经典降糖药及复合抗氧化剂对糖尿病大鼠降糖作用的比较，以及对STZ诱导糖尿病大鼠肝脏、胰腺损伤的保护作用。③通过给予实验动物模型经过筛选的有效抗氧化剂，观察抑制ROS、IR和糖代谢相关因子的作用效果，研究其在糖尿病发生过程中的抗氧化治疗作用机制。实验结果1.通过给予大鼠高脂高糖饲料及tBHP注射一个月后，使其处于氧化应激状态，大鼠机体ROS生成增加，抗氧化能力减弱，脂质过氧化加重。与对照组相比，HGF组和HGF+tBHP组的体重变化明显、空腹血糖和空腹胰岛素水平明显升高、血清胆固醇、血清甘油三酯和血清游离脂肪酸含量明显增加，胰岛素敏感性降低。实验证明，高脂高糖饲料加tBHP能够快速稳定建立胰岛素抵抗模型，同时病理片中肝细胞受到的ROS氧化损伤提示，肝脏损伤在很大程度上影响了糖脂代谢，对于IR的产生和发展起到了促进作用。2.通过研究不同剂量tBHP作用正常肝细胞QZG，我们发现，ROS显著影响胰岛素刺激下的Akt、AMPK的磷酸化，同时在低剂量的时候ROS促进Akt、AMPK的表达，而在高剂量时表现出明显的抑制作用。tBHP对胰岛素刺激下糖脂代谢相关因子的传导也产生了显著的影响作用，低剂量作用下IRS1、GLUT-4、PPARγ的表达明显增高，高剂量时则显著降低。其对抵抗素表达的影响则相反，表现为低剂量时抑制，高剂量促进。同时我们使用PPARγ增敏剂RSG、AMPK抑制剂及Resistin中和抗体，发现通过RSG刺激PPARγ的活化及抵抗素中和抗体抑制抵抗素都明显提高了AMPK的磷酸化水平。我们还研究了在100μM tBHP对胰岛素刺激下，增敏剂和抑制剂的干预对糖代谢相关酶mRNA的表达。结果提示：tBHP明显提高了糖异生关键酶PEPCK、G6Pase的mRNA水平，却抑制了GLUT-4mRNA水平。RSG给药组和抵抗素抑制组显著改变了这一情况，GLUT-4mRNA水平明显升高。相反PEPCK、G6Pase的表达受到抑制。体内实验在实验一建模成功的基础上，观察了给予IR大鼠腹腔注射抵抗素中和抗体和AMPK抑制剂后，以RSG为阳性对照组，AMPK抑制剂组中，血清胰岛素水平显著升高，胰岛素敏感指数明显降低；抵抗素中和抗体组受到抑制，胰岛素敏感性得到改善。血清中胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸的水平在抵抗素抗体组也明显降低，而在AMPK抑制剂组明显升高。血清、肝脏组织的氧化损伤指标变化提示，氧化应激是导致IR不可缺少的因素，通过干预，抵抗素抗体组的氧化损伤明显减轻，这也提示糖脂代谢紊乱在很大程度上通过提高抗氧化酶的活性减轻氧化应激损伤而得到改善。3.通过与罗格列酮和二甲双胍单独给药比较，联合了复合抗氧化剂的这两种药物明显的降低了血糖，氧化应激水平也显著降低。同时我们惊奇的发现，联合了抗氧化剂的治疗组，血糖不但降低，与单独给药组相比，血糖的水平更为稳定和持久，而单独给药组血糖水平后期波动明显。体外实验提示，联合给药组表现出了比单独用药更能降糖的作用，同时其通过刺激上调肝脏PPARγ的表达，抑制了抵抗素水平，从而上调了AMPK的表达，抑制了糖异生相关酶的活性，改善了糖代谢，逆转了糖尿病的发展。肝脏胰腺的病理切片显示，罗格列酮虽然降糖的效果明显，但其存在一定的肝损伤副作用，二甲双胍的也存在一定的肝损伤。但是通过与复合抗氧化剂联用，不但改善了肝损伤，且并不影响血糖的稳定。胰腺也有同样的结果，联合用药组更为显著的保护了胰腺损伤，改善了胰岛功能。结论：本课题通过建立高脂高糖联合低剂量氧化剂诱导IR大鼠模型，观察ROS在IR发生发展过程中的重要作用，探讨ROS刺激下的肝细胞中胰岛素相关信号通路PPARγ-Resisitin-AMPK间的相互调控关系，初步阐明了IR期间由于脂代谢紊乱，使PPARγ表达下调，引起抵抗素水平的升高，导致AMPK活性受抑制，糖代谢异常，最终导致糖尿病。同时，我们发现长期用药期间，单纯糖尿病药物虽能起到很好的降糖作用，但是随着时间的推移，其降糖效果不断下降，且存在一定的肝脏及胰腺的损伤。而联合用药组非常成功的解决了这一难题，使血糖在相当长一段时间内保持稳定，且明显减轻了脏器的氧化损伤。通过实验我们推测，抗氧化剂的这一功效很可能是通过调控PPARγ-Resisitin-AMPK信号通路改善糖脂代谢，逆转IR来实现的。本研究初步证明了糖尿病发生过程中存在氧化应激是致因，IR是关键，糖代谢失控是推手的“致病链”，抗氧化能够有效阻断这个“致病链”，为进一步探明T2DM的发生机制提供了初步实验依据，对于T2DM的预防和治疗也具有重要意义。