电化学生物传感器是将目标物与分子识别元件结合前后产生的各种物理、化学等信号转换为电化学信号的生物传感器。由于特异性识别作用强,操作简便,分析速度快,样品用量少,仪器设备简单等优点,电化学生物传感器在分析化学领域已经成为被广泛研究的热点之一。构建灵敏度高、选择性好、操作简便的电化学生物传感器对实现痕量目标物(如蛋白质、DNA、micro RNA、重金属离子等)的检测具有重要意义。本论文结合多种DNA信号放大策略,构建了一系列操作简便、成本低廉的电化学生物传感器,实现对家蚕微孢子虫总蛋白、Hg2+以及ATP的高灵敏、高选择性检测。其主要研究内容如下:1.基于Fe3O4NPs-DNA网状结构构建信号放大电化学免疫传感器对家蚕微孢子虫总蛋白的检测金属纳米粒子催化信号放大一般需在底液中加入催化底物,通过催化底液中的底物来加速电化学活性物质的电子转移,实现信号放大。这不仅会使催化剂和催化底物的作用距离较远,催化效率受限,还会使检测操作变得复杂。本实验基于Fe3O4NPs-DNA网状结构固载大量电活性物质亚甲基蓝(MB),并将Fe3O4NPs和MB同时固载到同一电极表面构建了一种信号放大的电化学免疫传感器实现对家蚕微孢子虫总蛋白(TP N.b)定量分析。一方面,自组装所形成的Fe3O4NPs-DNA网状结构能大量提高MB的固载量,增加传感器的电化学信号强度。另一方面,具有生物相容性的Fe3O4NPs不仅能作为固载平台,还能作为催化剂催化还原嵌入双链DNA中的MB,避免了使用蛋白酶所带来的高成本、易失活的缺点。此外,将Fe3O4NPs和MB同时固载到同一电极表面,不仅缩短了两者间的反应距离,有效提高了催化效率,还简化了实验操作。基于这样的策略构建的免疫传感器对目标分析物TP N.b的线性响应范围为0.001-100 ng·mL-1,检测限为0.35 pg·mL-1。本方法具有操作简便、响应迅速、成本低廉等优点,为实现高灵敏和高选择性检测其他蛋白质提供了一种新方法。2.基于核酸内切酶辅助循环和末端脱氧核苷酸转移酶辅助DNA扩增构建信号放大电化学传感器用于重金属Hg2+的灵敏检测聚合酶链式反应(PCR),滚环放大(RCA),环介导等温扩增(LAMP)等都能进行DNA扩增,然而这些扩增方式通常需要相对长的分析时间、价格昂贵的设备或复杂的探针设计过程。本体系引入末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)来扩增DNA,这种酶不依赖DNA模板,反应条件温和,能有效延长3′-OH端的DNA成长的单链DNA。在目标物Hg2+存在下,发夹DNA(HP1)发生构象变化,形成输出DNA(output DNA)并与电极表面3′-PO4末端标记的HP2杂交。接着核酸内切酶Nt.BbvCI在剪切位点对HP2进行剪切,释放出output DNA并参与下一个杂交循环过程,实现了output DNA的循环利用。与其他不需要特定序列剪切的酶类相比,这种剪切酶具有更强的特异性。留在电极表面被剪切的HP2裸露出延续的3′-OH端,在TdT酶作用下,HP2延长成长的单链DNA,静电吸附大量带正电的银离子(Ag+)。在还原剂的作用下,Ag+被还原成银纳米颗粒用以产生电化学信号,避免了加入电活性物质,简化了实验操作。TdT酶的引入使得Ag+的固载量大幅度增加,增强了电化学信号。以此构建的电化学生物传感器具有高的灵敏度和好的选择性,有望进一步扩展到其他重金属离子的检测。3.目标物驱动诱导的催化发夹自组装和DNAzyme循环构建无酶,信号放大电化学传感器用于ATP的检测酶辅助的信号放大方法虽然能提高传感器的灵敏度,但是酶不稳定,容易受到环境温度、pH等的影响,而且价格昂贵,因此构建简单、灵敏且无酶传感器十分必要。本实验基于目标物驱动的催化发夹自组装(CHA)和DNAzymes循环放大技术,构建了一种无酶、双重信号放大的电化学传感器定量分析ATP。两条适体链能同时识别目标物ATP形成杂交复合物,同时复合物可以诱导CHA循环反应转化成大量的酶链(HP1-HP2),有效地增加了ATP转化效率。接着,所形成的HP1-HP2与聚苯乙烯磁性微球上的底物链HP3杂交形成DNAzymes,在相应金属离子存在下催化剪切底物链,获得输出DNA片段S1,并释放出酶链引发剪切循环,进一步增加了ATP转换为S1的转化效率,提高了DNA放大效率。基于双循环放大,一个ATP就可以产生多个S1,为ATP的检测提供了一种灵敏的方法。实验结果表明,该传感器的线性范围为0.001 nmol·L-1-50 nmol·L-1,检测限为0.45pmol·L-1。这种放大方法无需使用任何蛋白酶,为构建简单、无酶的电化学传感器检测小分子、DNA、蛋白质、重金属离子提供了一种新思路。