前言随着现代工业发展和环境污染的日趋严重,人类先天性畸形发生率逐年上升,因此对先天性畸形的研究已越来越受到人们重视。神经管畸形(neural tubedefect,NTD)是最为常见,也是危害性最大的一类先天性畸形,因此,探讨NTD形态发生机制已成为畸形学研究中一个非常活跃的领域。一般认为,NTD是胚胎发育过程中多种基因调控和多种环境因素共同作用的结果。NTD具有一定遗传倾向,曾产下过神经管畸形婴儿的父母再次产下相同婴儿的风险是正常父母的3倍,NTD患者家族再发病率接近2-5%。环境因素也是影响神经管缺陷发生的重要因素,主要包括对胎儿发育有害的生物、化学、物理、药物等因素以及母体的营养状况等,诸如:接触铅、汞等重金属,使用抗生素、解热镇痛药、X射线,吸烟、酗酒等不良生活方式,摄入过量维生素A及维甲酸(retinoic acid,RA)等维生素A衍生物等。无脑畸形、脊髓裂是最为常见的神经管畸形,两者统称为开放性神经管缺陷。脊柱裂指脊椎骨发育不全,使本应有脊椎骨保护的脊髓突出或暴露于体表。脊髓裂常伴有脊柱裂。无脑畸形是一种最为严重的NTD,常伴有头盖骨和头部皮肤发育不全。这种胎儿一般出生前就死于子宫,形成"死胎"或"死产",即使活产,也会在短时间内死亡,几乎无一例存活。由于无脑畸形胎儿一般出生前就死于子宫内,故关于无脑畸形发生机制的研究大多在相应动物模型上实施。在已建立的NTD动物模型中,露脑畸形发生率低,且常常合并其他多种器官发育缺陷,即使对露脑畸形发生有遗传易感性的SELH/BC品系小鼠,其露脑畸形发生率也仅为53%。RA是维生素A在体内的自然活性代谢物,也是胚胎发育过程中不可缺少的形态发生素。它不仅决定胚胎头尾轴的建立,而且参与中枢神经系统发育过程中对前、中、后脑和脊髓的调节分化。一般认为,RA通过与维甲酸受体(retinoic acidreceptor,RARs)结合,调节下游靶基因表达,来实现其生物学效应。哺乳动物RARs一般包括α、β和γ三种亚型。RA先与RARs结合,然后RARs以二聚体的形式结合到靶基因启动子上一段称为维甲酸反应元件(retinoid acid responseelements,RARE)的特定DNA序列上,以调控靶基因转录。研究证实,过量维生素A及RA等维生素A衍生物可在小鼠、金黄地鼠、鸡等动物胚胎中诱导一系列发育缺陷,而中枢神经系统是RA致畸形发生的最常见部位。一般认为,RA致畸作用可能与其在时间和空间上不适当激活或抑制了其下游形态发生相关调控基因有关。细胞凋亡在神经管的正常形成过程中发挥重要作用,凋亡过度或减少均可致NTDs发生。研究表明,细胞凋亡参与RA致发育缺陷的发生。Caspase-3是细胞凋亡下游的关键执行者,细胞凋亡的某些特征性标志,如染色体凝聚和DNA片段化等,均与Caspase-3直接相关。Wnt蛋白是一类由Wnt基因编码的分泌型糖蛋白,通过与细胞膜上Frizzled受体家族和低密度脂蛋白受体相关蛋白家族(low-density lipoprotein receptorassociating protein,LRP)相互作用而启动Wnt信号传导,与胚胎发育及细胞增殖、分化和凋亡等密切相关。β-catenin是经典Wnt信号途径中不可缺少的关键性效应分子,一般通过激活T细胞因子/淋巴样增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor,LEF/TCF)家族中转录因子而发挥其发育调控效应。在中枢神经系统发育过程中,β-catenin参与细胞的增殖、分化、凋亡及神经管形态发生等一系列生物学过程,其表达失调可致神经管畸形、颅面部发育缺陷以及视杯和面部模式形成障碍。Dishevelled是胞质内多条Wnt信号转导途径的衔接子,在哺乳动物中至少包括3个亚型,即Dishevelledl/2/3。Wnt一旦与受体Frizzled结合,Dishevelled即与Frizzled受体胞内区结合,继而被激活。激活的Dishevelled蛋白使β-catenin在胞质内积累,并进入细胞核调控下游靶基因转录。Dishevelled还可激活平面细胞极性(planar cell polarity,PCP)信号通路,以调控细胞极性排列。PCP是一条非经典Wnt信号通路,它与经典Wnt信号通路一样需要细胞膜上Frizzled受体及胞浆内Dishevelled蛋白的参与,但其信号传递不依赖β-catenin分子。近年来相关研究表明,PCP信号通路在胚胎形成过程中,通过参与原肠胚/神经胚期会聚延伸(convergent extension,CE)运动参与调控神经管闭合过程。Vangl是PCP信号途径主要分子成员之一,在哺乳动物中主要包括两个亚型,即Vangl1/2,其突变可致NTD发生。本实验拟用RA建立小鼠露脑畸形动物模型,并利用免疫组化、原位杂交、Western-b1ot及RT-PCR技术初步探讨Dishevelled1/2/3亚型基因及经典Wnt信号通路分子β-catenin和PCP信号通路分子Vangl2在RA致小鼠胚胎畸形发生中的表达分布变化,以及PARα、PARβ及Caspase-3蛋白表达量的变化,以期阐明过量RA致NTD的发生机制,为NTD的预防与治疗提供实验依据。实验方法1.RA致昆明小鼠露脑畸形动物模型的建立及PARα、PARβ及Caspase-3蛋白检测:(1)RA致昆明小鼠露脑畸形动物模型的建立。成年未经产雌性昆明小鼠80只,体重25-35g,下午18:00将小鼠按雌雄比例2:1合笼,次日清晨8:00查见阴栓的雌鼠定为孕零天(E0)。将E0孕鼠随机分为对照组及实验组。实验组分别于E7.5、E7.75、E8.0、E8.5,按20mg/kg、30rag/kg、40mg/kg和50mR/kg剂量(每组5只),一次性灌服RA花生油悬液,对照组于相同时间灌服等量花生油。分别于E10.5/E16.5天颈椎脱臼处死孕鼠,剖宫计数各组胚胎植入数、吸收胚胎数、死胎数、活胎数及露脑畸形胚胎数并记录;分别测量E10.5和E16.5天时各组胚胎体重、顶臀长和尾长。经分析后,确定RA致小鼠NTD动物模型的最佳用药剂量和最佳用药时间。部分对照组及实验组胚胎分别与E7.75、E8.5、E9.5、E10.5及E11.5,常规制作连续横断面石蜡切片,HE染色,光学显微镜下观察各组胚胎神经管组织结构特点。(2)PARα、PARβ及Caspase33蛋白检测:Western-b1ot技术检测RA(E7.75,30mg/kg)处理后18、42、66及90h实验组及对照组小鼠胚胎神经管组织中RARα、PARβ及Caspase-3蛋白表达变化。蛋白表达强度用其灰度值与内参β-actin灰度值的比值表示,比值越高其表达越强。2.Wnt信号分子Dishevelled1/2/3、β-catenin及Vangl2的检测:采用原位杂交及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Dishevelled1/2/3、β-catenin及Vangl2 mRNA在实验组(E7.75,30mg/kg)及对照组处理后4、18、42及66h鼠胚神经管组织中的表达量及分布状况:采用免疫组化及Western-b1ot技术检测Dishevelled2、B-catenin及Vangl2蛋白在实验组及对照组处理后18、42、66及90h鼠胚神经管组织中的表达状况。实验结果1.露脑畸形动物模型:(1)RA诱导昆明小鼠露脑畸形发生率随药物剂量加大而升高,随胚龄增加而降低。E7.75灌服30mg/kgRA可诱导94%(E10.5)/76.9%(E16.5)露脑畸形胚胎发生率,是本实验确定的最佳致畸动物模型。2.PARα、PARβ及Caspase-3蛋白检测:Western-b1ot检测结果显示:(1)在正常对照组,PARα及PARβ蛋白在花生油灌服后18h表达升高,42h表达最强,之后表达又逐渐降低。在实验组,PARα及PARβ蛋白表达水平在RA灌服后18、42h,均明显低于正常对照组(P＜O.05);66h、90h时,PARα蛋白表达水平与对照组相比无明显差异,PARβ蛋白表达水平则显著高于正常对照组(P＜0.05)。(2)Caspase-3在正常胚胎神经管组织中的表达存在时间依赖性。在对照组,Caspase-3蛋白在花生油灌服后18h表达升高,42h和66h时表达最强,之后表达逐渐降低。在实验组,Caspase-3蛋白在RA处理后42h表达水平显著低于正常对照组(P＜0.05),66h和90h时,其表达水平显著高于正常对照组(P＜0.05)。3.Dishevelled1/2/3、β-catenin及Vangl2表达状况检测:(1)Dishevelled1/2/3在正常胚胎神经管组织中的表达存在时间依赖性。在对照组,Dishevelled1/2/3mRNA在花生油灌服后18h表达最强,之后表达逐渐降低到原来表达水平。在实验组,Dishevelled1/2/3 mRNA在RA处理后4h和18h的表达水平显著低于正常对照组(P＜0.05),42h时其表达水平升高并显著高于正常对照组(P＜0.05),66h时Dishevelled1/2在对照组与实验组中的表达无显著差异,Dishevelled3表达水平显著高于对照组水平(P＜O.05)。在对照组,Dishevelled2蛋白表达水平在花生油灌服后随着胚胎发育逐渐降低:在实验组,Dishevelled2蛋白在RA处理后18h表达水平显著低于对照组(P＜O.05),42h时其表达水平升高,且显著高于正常对照组(P＜0.05),66h和90h时实验组与对照组相比无显著差异。免疫组化检测显示:Dishevelled2蛋白在各对照组及实验组鼠胚头部神经管上皮组织中均呈不同程度阳性着色。在正常胚胎神经管组织中,其表达水平随胚胎发育逐渐降低;在实验组,Dishevelled2蛋白在神经管组织的表达呈现先下降,之后上升的趋势。(2)在对照组,β-catenin mRNA及蛋白表达随胚胎发育逐渐降低;实验组在RA灌服后4h和18h,β-catenin mRNA表达水平明显低于正常对照组(P＜0.05);42h时实验组与对照组相比无明显差异;66h时其表达水平明显高于对照组(P＜0.05);β-catenin蛋白在RA处理后18h和42h,表达水平显著低于正常对照组(P＜0.05),66h时实验组与对照组相比无显著差异,90h时其表达水平升高,且显著高于正常对照组(P＜0.05)。原位杂交及免疫组化检测显示:β-catenin在各对照组及实验组鼠胚头部神经管上皮组织中,均呈不同程度阳性着色。在正常胚胎神经管组织中,β-catenin mRNA及蛋白表达水平随胚胎发育逐渐降低;在实验组,β-catenin mRNA及蛋白表达水平均呈现先下降,而后又逐渐上升的趋势。(3)在对照组,Vangl2mRNA表达在花生油灌服后18h明显升高并于42h时达最高峰,之后逐渐降低到原来水平:Vangl2蛋白表达在花生油灌注后18h表达升高,42h时最强,66h和90h时明显降低。实验组在灌服RA后4h和18h,Vangl2mRNA表达水平明显低于正常对照组(P＜0.05):42h时两组相比无明显变化,66h时其表达水平显著高于对照组(P＜0.05):Vang1.2蛋白在RA处理后18、42h表达水平显著低于正常对照组(P＜0.05),66、90h时其表达水平升高,且显著高于正常对照组(P＜0.05)。原位杂交及免疫组化检测显示:Vang12在各对照组及实验组鼠胚头部神经管上皮组织中,均呈不同程度阳性着色。在正常组,Vangl2mRNA及蛋白表达水平随胚胎发育呈现先上升后下降的趋势:在实验组,其mRNA及蛋白表达则呈现先上升,而后逐渐下降的趋势。结论1.成功建立过量RA致昆明小鼠NTD动物模型:E7.75灌服小鼠30mg/kgRA,露脑畸形发生率为94%(E10.5)/76.9%(E16.5)。2.RA参与小鼠胚胎神经系统正常发育。3.过量RA可能通过调节RARα和RARβ的表达,影响下游相关发育基因的正常调控,从而干扰神经管闭合过程,导致NTD发生。4.细胞凋亡参与胚胎神经系统正常发育,过量RA可能通过Caspase-3干扰正常细胞凋亡,导致NTD的发生。5.Wnt信号通路参与小鼠胚胎神经系统正常发育,过量RA可干扰Wnt信号通路分子Dishevelled1/2/3、β-catenin及Vangl2基因在神经管组织中的正常表达,导致NTD的发生。