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研究背景与目的基因治疗技术是当前肿瘤研究中的热点,但面临着如何提高治疗基因的疗效和解决其靶向性表达的问题,而放射性碘对分化型甲状腺癌细胞则具有着高效、特异性的杀伤效果,其摄碘和贮碘的分子基础在于细胞膜上存在着人钠碘转运体(hNIS)和人甲状腺过氧化物酶(hTPO)。因此,本研究拟构建并应用重组腺病毒作为基因转移载体,将hNIS和hTPO基因联合转染入胶质瘤细胞,评估转染后细胞的摄碘能力,以及放射性碘在细胞内的代谢动力学变化,并进一步评价放射性碘对胶质瘤细胞的杀伤效果。同时在腺病毒载体中引入人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子,通过实验分析其靶向性引导hNIS在胶质瘤细胞中特异性表达的作用。方法1、使用RT-PCR和荧光定量PCR检测多种肿瘤及正常细胞中的hTERT表达活性；通过PCR及pMD-18T质粒载体对hTERT核心启动子进行扩增和克隆；以pGL3-Basic为载体构建含hTERT启动子和hNIS基因的重组质粒,并通过荧光素酶活性实验检测hTERT启动子在不同细胞中的启动效率2、应用Adeasy系统构建含目的基因的重组腺病毒载体,并对病毒进行滴度测定和转染细胞后表达产物的鉴定。3、使用重组腺病毒Ad-hTERT-hNIS单独转染,及与Ad-CMV-hTPO联合转染胶质瘤细胞U251和U87,确定最适感染复数；进行摄125Ⅰ实验、125Ⅰ内、外流实验分析放射性碘在胶质瘤细胞内的代谢动力学变化；通过NaC104抑制实验和有机化测定实验验证hNIS和hTPO的作用；并进行克隆形成实验评估放射性131Ⅰ对不同转染组的细胞的杀伤效果。结果1、RT-PCR的结果显示在H460、U251、U87、ARO及FRO等细胞中均存在hTERT mRNA的表达,只是活性的高低不一；而在正常细胞MRC-5中无表达。荧光定量PCR的结果显示在胶质瘤细胞U251和U87内存在hTERT的高活性表达,与内参基因β-actin对照,其相对含量分别为0.18%和0.12%。2、成功构建并鉴定了含3种不同长度hTERT启动子序列(260 bp、456 bp及1453bp)的pMD-18T和pGL3重组质粒,并成功构建并鉴定了含260 bp hTERT启动子及hNIS基因的重组质粒pGL3-hNIS。3、荧光素酶活性实验结果显示,在上述肿瘤细胞中,3种hTERT启动子片段均可诱导荧光蛋白的表达,但其启动效率存在差异,其中pGL3-204中的启动子片段(260 bp)在FRO、H460和U251中启动效率最强,可以达到SV40启动子的80%。4、构建并纯化了重组腺病毒Ad-CMV-hTPO,空斑形成实验测定其滴度约为1.0×109pfu/ml,感染293细胞后行Western blot结果显示在110 kD处可见阳性反应条带,为表达的hTPO目的蛋白。5、摄碘实验结果显示,单独转染组(Ad-hTERT-hNIS)的胶质瘤细胞U251和U87均具有了较强的摄碘能力,分别提高了30.76倍和29.66倍；而联合转染组(Ad-hTERT-hNIS/Ad-CMV-hTPO)的摄碘能力又均有轻度增高,分别为35.55倍和32.88倍。6、125Ⅰ的内、外流实验显示单独转染组的胶质瘤细胞能够快速的摄碘,峰值均出现在约40 mmin时；但碘的流出也较迅速,Te约为11-12 min；而联合转染组则可以在一定程度上延缓125Ⅰ的外流,Te约为18-20 mmin。7、过氯酸盐抑制实验结果显示,不同浓度的NaC104均可抑制转染后胶质瘤细胞对125Ⅰ的摄取,抑制率约为93.50-94.48%。有机化测定实验结果显示,联合转染组细胞内与蛋白结合的125Ⅰ量高于单独转染组,约为后者的3倍。8、克隆形成实验结果显示经131Ⅰ治疗后,联合转染组的克隆形成率降低得最为明显,U251和U87分别降低了11.37和14.52倍；其次为单独转染组,分别降低了5.52和6.05倍(P均<0.01)。结论1、在胶质瘤U251和U87等多种肿瘤细胞中均存在hTERT不同活性的表达,因此可以应用hTERT启动子引导治疗基因在胶质瘤细胞中的特异性表达。而且hTERT核心启动子具有较高的启动效率,可以替代全长启动子引导hNIS基因表达。2、携带hTERT启动子和hNIS基因,hTPO基因的重组质粒及腺病毒载体构建成功,应用Ad-hTERT-hNIS单独转染胶质瘤细胞后可以使其获得较强的摄碘能力,从而能够介导放射性碘杀伤肿瘤细胞。3、在单独转染hNIS基因的胶质瘤细胞中碘会快速的外流,与Ad-CMV-hTPO联合转染后可以增加与蛋白结合的碘量,使碘在细胞内的停留时间有所延长,从而提高放射性碘对胶质瘤细胞的杀伤效果。