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炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一组反复发作的慢性肠道炎症性疾病,主要包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC),其发病率在全球呈逐年上升的趋势。IBD的病因和发病机制至今尚不明确,目前大多数学者认为环境因素、遗传易感性、肠道感染、免疫因素等共同参与了疾病的发生过程。炎性肠道组织大量淋巴细胞浸润是IBD的重要病理学特征。T细胞亚群中效应性T细胞(Effector T cells,Teff)和调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)相互制衡、协调,共同维持机体免疫系统的平衡。汉黄芩素(Wogonin)为一种纯天然黄酮类化合物,具有抗肿瘤和抗炎活性。为观察汉黄芩素对局部肠道炎症的作用,本研究基于右旋葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导的小鼠肠炎模型观察汉黄芩素对小鼠肠炎发病的影响以及体内Teff/Treg细胞功能的变化;其次体外分析了汉黄芩素对Teff/Treg细胞功能的直接影响;最后进一步探讨汉黄芩素调节Teff/Treg细胞功能活性的作用机制。研究内容分为2部分:1.汉黄芩素对DSS诱导小鼠肠炎及Teff/Treg细胞功能活性的的影响目的:观察汉黄芩素对DSS诱导小鼠肠炎发病的影响,分析肠炎小鼠脾脏及肠道Teff/Treg细胞功能的变化,并体外分析汉黄芩素对Teff/Treg细胞功能的直接影响。方法:采用2.5%DSS溶液诱导C57BL/6小鼠肠炎模型,腹腔注射不同剂量汉黄芩素(50 mg/kg、100 mg/kg),观察小鼠的体重、血便、腹泻等情况计算疾病活动指数。流式细胞术检测脾脏内CD4+CD25+Foxp3+、CD4+CD25+CD127-T细胞的频率及肠道组织CD4+CD25+CD127-T细胞的频率和细胞绝对数。给C57BL/6正常小鼠腹腔注射不同剂量汉黄芩素,观察汉黄芩素对正常小鼠的影响。磁珠分选CD4+、CD8+T细胞,经不同浓度汉黄芩素体外刺激后qRT-PCR检测CD4+、CD8+ T细胞IFN-γ mRNA的表达水平。CD8+ T细胞经不同浓度汉黄芩素刺激后与小鼠结肠癌细胞系MC-38共孵育,分析CD8+T细胞对靶细胞的杀伤活性。磁珠分选CD4+CD25-T细胞,加入anti-CD3、anti-CD28、IL-2及TGF-β,不同浓度汉黄芩素体外作用于TGF-β诱导生成的CD4+CD25+T细胞(Ti-Treg),流式细胞仪检测汉黄芩素处理后CD4+CD25+Foxp3+T细胞频率的变化。结果:体内腹腔注射不同剂量汉黄芩素(50mg/kg、100mg/kg)均可加剧DSS诱导的小鼠肠炎的发病,小鼠体重下降更剧烈,肠腔狭窄、肠道短缩及肠道坏死现象明显,汉黄芩素100 mg/kg处理组效果最为显著;腹腔注射不同剂量汉黄芩素对C57BL/6正常小鼠无明显影响。与对照组相比,汉黄芩素联合DSS刺激组小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+、CD4+CD25+CD127-T细胞的频率显著下降,肠道组织CD4+CD25+CD127-T细胞的频率及细胞绝对数均明显下降。汉黄芩素体外刺激可提高CD8+T细胞杀伤MC-38靶细胞的活性,且CD4+、CD8+T细胞IFN-γmRNA的转录水平均显著增高。TGF-β体外诱导生成的CD4+CD25+T细胞经汉黄芩素处理后,CD4+CD25+Foxp3+T细胞的频率明显下降。结论:汉黄芩素具有增强Teff细胞功能、抑制Treg细胞功能的活性,腹腔注射50 mg/kg、100 mg/kg汉黄芩素均可加剧DSS诱导小鼠肠炎的发病,在剂量为100 mg/kg时作用更为显著,间接证明汉黄芩素具有免疫增强活性。2.汉黄芩素调节Teff/Treg细胞活性的分子机制目的:探讨汉黄芩素调节Teff/Treg细胞活性的分子机制。方法:磁珠分选CD4+T细胞,加入IL-2和不同浓度汉黄芩素(50μg/ml、100 μg/ml)刺激24小时,提取细胞全蛋白。磁珠分选CD4+CD25-T细胞,加入anti-CD3、anti-CD28、TGF-β和IL-2体外诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+调节性T细胞,至第6天加入不同浓度汉黄芩素(50 μg/ml、100 μg/ml)刺激24小时,提取细胞全蛋白。Western blot分别检测Teff/Treg细胞STAT3及磷酸化STAT3(Tyr705、Ser727)、NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65、Erk及磷酸化Erk蛋白的表达情况。结果:汉黄芩素处理后的Teff细胞与对照组相比,p-NF-KB p65的表达水平显著上调;汉黄芩素处理组p-p44/42(Erk1/2)的表达升高,在剂量为50μg/ml时最为显著;与对照组相比,100μg/ml汉黄芩素可下调STAT3总蛋白及p-STAT3(Y705)蛋白的表达,不同剂量汉黄芩素均可下调p-STAT3(S727)的表达,且呈剂量依赖性。汉黄芩素处理后的Treg细胞较对照组p-NF-κB p65的表达水平上调;汉黄芩素100 μg/ml可抑制p44/42(Erk1/2)的磷酸化,而50 μg/ml汉黄芩素与对照组相比无明显差异;100μg/ml汉黄芩素显著下调STAT3总蛋白及p-STAT3(Y705)的表达,而不同剂量汉黄芩素则促进STAT3-S727的磷酸化。结论:汉黄芩素可能通过激活NF-κB、Erk信号通路,下调STAT3的表达及其磷酸化水平促进CD4+T细胞的活化;汉黄芩素可上调p-NF-KBp65、p-STAT3(S727)的表达,下调p-Erk、p-STAT3(Y705)的表达,从而抑制Treg细胞的功能。