目的生物芯片诞生于上世纪90年代初,是近年来高新技术领域中极具时代特征的重大进展,是物理学、微电子学与分子生物学综合交叉形成的高新技术。被广泛应用于疾病诊断等多方面。目前,白血病的免疫分型诊断主要依靠用已知的单克隆抗体(McAb)去鉴定白血病细胞表面或胞浆抗原-CD抗原(cluster ofdifferentiation),根据不同抗原在不同阶段的出现与消失,决定白细胞所属的系列及分化阶段,做出免疫学诊断。本实验室构建的白血病免疫学分型细胞芯片就是利用抗原、抗体特异性结合的原理,将白细胞表面分化抗原单克隆抗体固定于载体上,形成抗体点阵。不同的单克隆抗体能够自动识别和捕获表达相应表面分化抗原的细胞,从而对白血病进行免疫学分型。这种对白血病进行免疫学分型的方法较免疫细胞化学和流式细胞仪检测法具有高通量、使用简便、样品用量少、检测速度快、灵敏度高、经济实用等优点。但是,白血病免疫分型细胞芯片作为一种新型的方法,需要传统公认的免疫细胞化学技术和流式细胞术的验证。另外,白血病免疫分型的检测,需要细胞表面抗原和胞浆抗原的检测,尤其是在双表型检测及特殊表型的检测时,胞内抗原的检测更是十分重要的。澳大利亚悉尼大学医学研究所的Larssa Belov等所研制的白血病免疫分型抗体微阵列,仅能检测细胞表面分化抗原,而我们实验室所研制的芯片以具有透明性的玻璃为载体,在表达相应CD抗原的白细胞与芯片上的抗体结合后,在其上用免疫细胞化学,来检测胞浆内的分化抗原,将结果直观、稳定的表现出来,为临床诊断提供更快速、简便、完善、准确的白血病免疫分型诊断方法。方法1、确定芯片上捕获细胞的最佳固定方法制备细胞芯片,室温条件下,分别用下列固定剂固定(1)甲醇:丙酮(1:1v/v)90秒;(2)95%乙醇3分钟;(3)95%乙醇:冰醋酸(AA液95:5v/v)3分钟;(4)AF液(95%乙醇:甲醛:水=68.4:10:21.6v/v)1分钟。除AF液固定后用蒸馏水洗2遍外,其余固定剂固定后芯片自然风干。免疫细胞化学后显微镜下观察点阵捕获的细胞形态、抗原的表现情况、细胞核复染着色情况及计数固定前后细胞数量。2、确定细胞芯片上的免疫细胞化学所用单克隆抗体的最佳浓度在相同条件下,细胞芯片上细胞用最佳固定方法固定,进行酶标免疫细胞化学,第一抗体抗CD7、抗CD13、抗CD19、抗MPO浓度分别为4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml,阴性对照滴加等量PBS,室温下孵育1小时;DAB显色,显微镜下观察结果。3、用免疫细胞化学法染色细胞芯片捕获细胞的胞膜及胞浆抗原细胞芯片,用最佳方法固定,按1μg/ml最佳浓度稀释免疫细胞化学第一抗体羊抗人抗CD7、抗CD13、抗CD19、抗MPO,阴性对照用PBS缓冲液代替第一抗体,免疫细胞化学染色后,显微镜下观察结果。4、检测细胞芯片捕获细胞的特异性细胞芯片,用最佳方法固定,按1μg/ml最佳浓度稀释免疫细胞化学第一抗体抗CD7、抗CD13、抗CD19,阴性对照用PBS缓冲液代替第一抗体,进行免疫细胞化学操作后,显微镜下每种抗体点上取三个高倍镜视野,计数细胞总数和有棕色颗粒的阳性细胞数,计算阳性率。5、应用细胞芯片进行白血病免疫分型并用免疫细胞化学法验证特异性制备应用于白血病免疫分型的细胞芯片,从白血病患者的外周血中提取白细胞,吖叮橙染色,孵育芯片,PBS清洗,扫描,检测信号,得到白血病免疫分型结果。再用免疫细胞化学验证。结果1、细胞芯片捕获细胞的固定方法以AF液(95%乙醇:甲醛:水=68.4:10:21.6v/v)1分钟最佳2、细胞芯片上的免疫细胞化学所用单克隆抗体的浓度以1μ/ml室温下孵育1小时最佳。3、细胞芯片上免疫细胞化学第一抗体为抗CD7、抗CD13、抗CD19时,棕色颗粒在细胞膜上;第一抗体为抗MPO时棕色颗粒在胞浆中。4、细胞芯片的特异性捕获阳性率在96.7±0.4%以上,非特异性捕获阳性率在0.8±0.3%以下,具有明显的特异性。5、白血病细胞芯片的特异性捕获阳性率在97.4±0.2%以上,具有明显的特异性。结论1、白血病免疫分型芯片捕获细胞的固定用AF液(95%乙醇:甲醛:水=68.4:10:21.6v/v)室温下固定1分钟最佳。2、免疫细胞化学第一抗体以1μg/ml室温下孵育1小时为最佳。3、芯片捕获细胞用免疫细胞化学法将胞浆、胞膜抗原染色出来。4、用免疫细胞化学法验证细胞芯片捕获细胞具有高度特异性。5、用白血病免疫分型细胞芯片对30例白血病患者外周血进行免疫学分型,同时进行免疫细胞化学分析,诊断结果准确、可靠。