论文部分内容阅读
人表皮生长因子（human Epidermal growth factor,hEGF）被广泛应用于皮肤创伤修复。然而,其稳定性差、透皮吸收效果不佳等缺点严重限制了其在临床中的应用。因此该课题针对hEGF的临床应用限制,将hEGF基因与油体蛋白基因oleosin相融合,构建了pOTB-oleosin-hEGF表达载体,且在红花种子中表达oleosin-hEGF融合蛋白。Oleosin-hEGF融合蛋白的表达可以克服天然hEGF的不足,使其能够在体外稳定储存,为后续更好的开发利用hEGF奠定了基础。T3代转基因红花种子播种后,待长出4-6片新鲜嫩叶,采摘新鲜叶片0.2g,对其基因组进行PCR检测;待红花种子成熟后,从种子中提取目的蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot来鉴定转基因红花种子中是否能成功表达出目的蛋白oleosin-hEGF,通过Quantity One软件对各株系表达的oleosin-hEGF蛋白进行半定量分析。随后制备小鼠在体透皮吸收实验模型,通过病理切片和蛋白免疫杂交实验来评估oleosin-hEGF融合蛋白的透皮吸收效果。利用MTT法检测oleosin-hEGF促进NIH/3T3细胞的增值活性。然后构建了大鼠皮肤机械损伤模型,经过不同给药处理之后,通过病理切片、相关基因和蛋白表达情况来评价oleosin-hEGF对大鼠皮肤创伤修复药效学活性。得出研究结果如下:（1）通过梯度离心的方法获得较为纯净的T3代转基因红花油体,然后在显微结构观察中可以看出转基因红花油体分散均匀;通过粒径测量得出转基因红花油体的粒径分布于700-1000nm之间,这比野生型红花油体粒径（1.5μm-2.5μm）大幅度缩小。（2）T3代转基因红花基因组PCR检测结果显示,在342bp处出现目的条带,与阳性对照完全相同。SDS-PAGE和Western blot实验中,在31kDa处出现目的条带,与oleosin-hEGF融合蛋白的理论值大小相同。以hEGF标准蛋白为阳性对照,通过Quantity One软件对各株系表达的oleosin-hEGF蛋白进行半定量分析,结果得出在T3-17号株系中,每克红花种子中最高含有69.32 mg的目的蛋白。（3）使用来自T3-17转基因种子油体表达的oleosin-hEGF融合蛋白检测细胞增殖活性。由于bFGF蛋白具有更好的促进细胞增殖的能力,因此以bFGF蛋白为标准来检测油体表达的oleosin-hEGF融合蛋白促进NIH/3T3细胞增殖的活性。结果表明,油体表达的oleosin-hEGF融合蛋白促进NIH/3T3细胞的增殖活性与bFGF标准蛋白大致相同。而野生型油体并没有明显的增殖活性。说明,来自T3-17转基因种子油体表达的oleosin-hEGF融合蛋白对NIH/3T3细胞具有显着的增殖活性。（4）Oleosin-hEGF透皮吸收实验结果显示oleosin-hEGF处理组中小鼠皮下组织中出现大量棕色信号（阳性蛋白）。在oleosin-hEGF组中,给药后30min oleosin-hEGF蛋白吸收达到最大值;而hEGF蛋白处理组中透皮速率相对较慢,给药后30min hEGF蛋白在皮肤中才开始吸收,直至给药后60min,hEGF蛋白的吸收才达到最大量,但是由于hEGF的不稳定性,给药60min后其在小鼠体内的含量有所下降,而oleosin-hEGF经皮给药后的渗入量从30min到60min一直维持较高水平。（5）在机械损伤大鼠皮肤实验中,oleosin-hEGF融合蛋白和hEGF标准蛋白治疗伤口后,均可以加快伤口愈合。但是,在给药处理后的第4d、7d和14d,oleosin-hEGF融合蛋白处理组伤口愈合率均比hEGF处理组高（P<0.05）;观察新生皮肤病理切片发现,oleosin-hEGF融合蛋白处理组从新生皮下结缔组织排列完整性,胶原沉积量和新生表皮细胞数量以及新生血管的再生情况都要明显优于空白对照组、野生型红花油体处理组和hEGF标准蛋白处理组;同时从新生皮肤组织中提取出总RNA和总蛋白,通过qRT-PCR和Western blotting检测内源性TGF-β1、bFGF和VEGF的表达发现TGF-β1、bFGF和VEGF在创伤修复的整个过程中均呈现出4d到7d先上升,在第7d达到最大值,随即从7d到14d下降,在第14d恢复至正常水平,这表明oleosin-hEGF融合蛋白具有更好的促进创伤修复的作用。