论文部分内容阅读
通过对本研究小组鉴定的DPV UL34基因(GenBank登录号EF643562)开展了以下系列研究:DPV UL34基因序列克隆、生物信息学分析和密码子使用分析、原核表达和抗体制备、表达产物在DEF中的定位、利用UL34蛋白PcAb IFA法检测该蛋白在人工感染鸭体内的分布、基因在DEF中的转录和表达时相分析等,结果如下:1.DPV UL34基因的克隆和分子特性分析通过对DPV基因文库中的一个重组子进行测序和ORF分析,发现为DPV UL34基因(GenBank登录号EF643562)。根据序列设计一对引物P1/P2进行PCR扩增并克隆到pMD18-T载体上,双酶切和测序结果表明克隆片段大小与预期一致。生物信息学分析发现:该基因编码276个氨基酸的多肽,含有疱疹病毒UL34类似蛋白家族保守区。系统进化树分析显示其与α疱疹病毒亚科中的属于马立克病毒属的GaHV-2、GaHV-3、MeHV-1、EHV-1和水痘病毒属的CeHV-9、HHV-3的亲缘关系最近,揭示DPV应该被划为α疱疹病毒亚科中的单独一类。该编码蛋白在252-274个氨基酸之间有一个明显的跨膜区,C末端有一微体靶向序列(ARL),但无信号肽序列;含有4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个蛋白激酶C磷酸化位点,5个N-豆蔻酰化位点和1个N-糖基化位点;密码子分析显示该基因偏爱以AT结尾的碱基,属于低表达基因。该分析结果有力的揭示了DPV UL34基因为一C端锚定的膜蛋白,为进一步开展该基因生物学功能的研究具有一定的参考作用。2.UL34基因的表达和抗血清的制备通过构建pET-32/UL34重组原核表达载体,利用IPTG进行诱导表达,得到大小为52kDa的重组融合蛋白,与预期蛋白大小相一致。可溶性分析表明主要以包涵体的形式存在,最佳表达优化条件为0.4mmol/L的IPTG,37℃下诱导4h。重组蛋白过柱纯化后制备的兔抗UL34血清琼扩效价为1:32。Western blot结果表明,该蛋白能与兔抗DPV全血清和UL34蛋白抗血清相互作用,证明UL34编码蛋白具有免疫原性。兔抗UL34 IgG经硫酸铵盐析和High-Q阴离子交换层析纯化具有高效、特异性强的优点。3.DPV UL34编码蛋白在DEF中的定位研究以纯化的兔抗—UL34 IgG作为一抗进行免疫荧光染色检测UL34蛋白在DEF中的定位,结果发现该编码蛋白主要存在于感染细胞的核膜;特异性荧光可最早在感染后12h的细胞核膜中检测到,24h大量绿色荧光聚集于核膜;48h后随着细胞的崩解和细胞形态的破坏使得绿色荧光显著减弱。该实验结果进一步证明了UL34蛋白是一种Ⅱ型膜蛋白,与生物信息学分析的结果具有一定的一致性,在DPV核衣壳的出芽过程中扮演了重要的角色。4.DPV UL34抗原在人工感染鸭体内的分布用DPV感染成年鸭复制鸭瘟急性病例,取试验组和对照组不同组织进行石蜡包埋,采用IFA检测石蜡切片中UL34抗原在人工感染鸭组织中的定位分布。结果表明:肝、脾、肺、肾、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠、法氏囊等组织的免疫荧光呈阳性或强阳性,而在脑、肌肉等组织荧光较弱。试验结果表明,消化器官和免疫器官为DPV的主要靶器官。5.DPV UL34基因在DEF中的转录和表达时相研究根据UL34基因序列和β-actin管家基因分别设计了目标基因引物U3/U4和内参引物U1/U2。利用Trizol抽提法分别提取感染DPV后1h、2h、4h、8h、12h、16h、18h、24h、28h、32h、36h、42h、48h、52h、60h、66h、72h等不同时间段的DEF的RNA进行反转录,然后以cDNA为模板进行FQ-PCR扩增。结果表明UL34基因的转录在12小时后出现显著增加;在28h左右出现峰值,随后又急剧下降;在约32h后达到一个相对稳定的水平。收集感染DPV不同时间段的DEF,通过反复冻融和利用细胞裂解液抽提病毒蛋白,Western blot实验表明UL34蛋白最早在感染后12h能够检测,随着感染时间的延长,病毒表达量逐渐增加。证实了UL34基因的转录和表达时相与DPV的增殖规律一致,为病毒的一个晚期基因,且具有边转录边表达的特点。