一、研究背景肺癌是当前世界上致死人数最多的肿瘤,约90%癌症患者死亡是由肿瘤转移引起的。发生转移的第一步是局限性侵袭,需要原发瘤发生许多表型改变,其中恶性肿瘤上皮向间质细胞转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是引起肿瘤远处转移的关键步骤。正常上皮组织的多层细胞结构不利于恶性肿瘤细胞的运动和侵袭,为获得运动和侵袭能力,肿瘤细胞必须丢失许多上皮细胞表型,使上皮层发生EMT。发生EMT细胞,一方面失去上皮细胞典型形态,上皮细胞间相互作用消失,组织结构松散,立方上皮细胞转变为纺锤形纤维细胞形态,并表现出侵袭性；另一方面,细胞基因表达谱发生改变,上皮细胞标志蛋白如E-cadherin的表达下调,而间质细胞标志蛋白如N-cadherin表达上调。实体肿瘤中央的细胞为上皮细胞表型,周围的细胞常常会呈间质细胞表型,其较强的运动能力使肿瘤细胞在局部产生浸润,并侵入血和淋巴管而转移至靶器官,随后癌细胞可发生间质向上皮转化(mesenchymal-epithelial transitions, MET)来重建细胞间连接及细胞骨架,从而形成转移灶。因此EMT是一个多步骤的动态可逆的变化过程。microRNA (miRNA)是广泛存在于真核生物中的非编码小分子RNA。miRNA具有明显的结构特征,成熟的miRNA通常是长度20-25个核苷酸的单链结构,其5’端有一磷酸基团,3’端为羟基。miRNA与其靶基因mRNA的3’非编码区结合,通过抑制翻译和促进mRNA的降解而抑制靶基因的表达。由于miRNA与其它靶基因不是完全互补,同一个miRNA可以有多个靶点。而同一个miRNA有两条部分互补的双链,根据在pre-miRNA上的位置分命名为5p和3p,这两条链可以结合在不同的mRNA上,行使不同的功能。越来越多的证据表明,miRNA与肿瘤的发生发展密切相关,包括细胞的增殖、侵袭和迁移以及EMT。发现的与肿瘤相关的miRNA,一部分促进肿瘤的发生发展,而另一些则抑制肿瘤肿瘤的发生发展。随着研究的越来越深入,预计将发现更多的与肿瘤相关的miRNAo miRNA在肿瘤中的表达常常是失调的,不仅具有组织特异性,而且具有肿瘤发生的阶段特异性,分析肿瘤组织特异的miRNA表达谱可应用于肿瘤的早期诊断并且指导治疗。因此,miRNA的研究对于肺癌的诊断、治疗以及预后估计有重要意义。Rho家族GTP酶参与了多个生命进程,包括细胞运动,细胞间的黏附等。RhoGDI通过将Rho抑制在非活性状态而抑制Rho家族GTP酶的活性。目前,人体内有三种RhoGDIs,分别命名为RhoGDIl (a)、RhoGDIB (P)和RhoGDIG(γ)。其中,RHOGDI1是分布最广泛,研究最为深入的成员,它可以与多个小Rho蛋白相互作用,包括RhoA、RhoC、Rac1和Cdc42等。RhoGDI1在乳腺癌、肝癌等肿瘤中低表达,被认为是一个抑制肿瘤转移的基因。我们的研究发现RhoGDI1是miR-483-5p的直接靶点,miR-483-5p能够通过抑制RhoGDI1的表达而激活包括Rac1和Cdc42在内的Rho GTPases。我们首次发现下调RhoGDI1能够激活内皮向间质转化的关键转录因子Snail进而促进EMT。此外,过表达RhoGDIl能够完全逆转miR-483-5p增强肿瘤细胞侵袭迁移能力,也能够完全逆转miR-483-5p促进EMT的作用。这些研究结果提示,下调RhoGDIl在miR-483-5p增强肿瘤细胞的侵袭迁移能力促进EMT的发生的过程中发挥关键作用。ALCAM属于免疫球蛋白超家族粘附分子,越来越多的研究表明,ALCAM参与了多种癌细胞的黏附改变、侵袭能力的改变,在黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等癌症中,ALCAM的表达使得肿瘤细胞保持在原位生长并抑制了肿瘤侵袭转移,而ALCAM表达的减少减弱了由其介导的肿瘤细胞间的群集,增强了肿瘤细胞的移动性,并可使肿瘤从原来的膨胀性生长发展成向周围组织的浸润性生长。在本研究中,我们发现在肺癌细胞中ALCAM是miR-483-5p的靶基因,受到miR-483-5p下调。干扰ALCAM能够抑制肺癌细胞的侵袭和迁移,而过表达ALCAM能够部分逆转miR-483-5p对肺癌细胞侵袭和迁移的调节。这些结果提示,对ALCAM的下调在miR-483-5p促进肿瘤细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用。microRNA-483 (miR-483)最早在人胚肝中发现。越来越多的研究发现miR-483在多种肿瘤中异常表达。miR-483在肾上腺皮质瘤、嗜铬细胞瘤和膀胱癌等肿瘤中表达量上升,且在转移肿瘤的表达高于良性肿瘤。在上述肿瘤中miR-483的过表达与低生存率密切相关。这些研究说明miR-483在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色。虽然这些研究将miR-483与肿瘤转移联系在一起,但miR-483的具体功能以及相应的机制还没有报道,需要进一步研究。二、研究结果1 miR-483-5p促进肺癌细胞运动、EMT及肺癌转移(1)miR-483诱导肺癌细胞发生EMT并提高肺癌细胞的侵袭迁移能力。为了研究miR-483对肺癌细胞的影响,我们在肺癌细胞A549和PC9中过表达miR-483,结果显示miR-483能够诱导肺癌细胞发生EMT。首先我们构建了miR-483过表达质粒pcDNA3.1-miR-483。将这一质粒转染A549细胞,四天后观察细胞形态,发现与转染空白质粒的A549细胞短圆相比,过表达miR-483的细胞形态变得瘦长,呈梭形,由间质样向上皮样转化。此外,细胞骨架F-actin从杂乱分布转变为束状分布。细胞的这些变化提示,过表达miR-483可能促进了细胞发生EMT。为了进一步确认细胞发生了EMT,我们检测了EMT相关蛋白在过表达miR-483后A549细胞和PC9细胞的中的变化,结果显示与对照相比,过表达miR-483的肺癌细胞的间质细胞标志分子N-cadherin和Fibronectin表达升高,而上皮细胞标志分子E-cadherin表达下降,这一变化符合EMT蛋白的变化特征。上述结果说明miR-483能够诱导肺癌细胞发生EMT。此外,我们检测了肺癌细胞的增殖情况,结果显示转染miR-483并不影响肺癌细胞的增殖,说明miR-483对肺癌细胞EMT的影响与细胞增殖无关。(2)过表达miR-483提高肺癌细胞的迁移和侵袭能力为了检测miR-483对肺癌侵袭潜能的影响,我们采用Transwell实验检测了两种细胞系过表达miR-483后侵袭和迁移能力的变化。结果显示,与对照相比,miR-483过表达能够显著提高肺癌细胞A549和PC9的侵袭和迁移能力(P<0.05)。(3) miR-483-5p诱导肺癌细胞发生EMT,并提高肺癌细胞的迁移和侵袭能力成熟的miRNA含有两条链,由于分别位于pre-miRNA的3’端和5’端而分别被命名为3p和5p。miR-483也含有两条链,分别是miR-483-3p和miR-483-5p,有研究发现这两条链在多种肿瘤中表达量增高,并与肿瘤转移正相关。为了确认哪一条链发挥作用,我们分别转染miR-483-3p和miR-483-5p的mimics至肺癌,结果显示,只有转染miR-483-5p的A549细胞形态发生了由间质样向上皮样转化,而转染miR-483-3p的细胞没有发生显著变化。我们进一步检测了蛋白水平的变化,结果显示转染miR-483-5p的肺癌细胞的间质细胞标志分子N-cadherin和Fibronectin表达升高,而上皮细胞标志分子E-cadherin表达下降,而转染miR-483-3p对这些蛋白没有显著影响。而应用抑制剂抑制miR-483-5p的作用,结果显示抑制剂对EMT的作用与miR-483-5p mimics的相反。这些结果说明,是miR-483-5p诱导了肺癌细胞由间质样向上皮样转化,而不是miR-483-3p。我们进一步检测了miR-483-3p和miR-483-5p对肺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。结果显示,miR-483-5p能够显著增强肺癌细胞的侵袭和迁移(P<0.05),而转染miR-483-3p后肺癌细胞的侵袭和迁移能力没有显著变化(P>0.05)。而应用抑制剂抑制miR-483-5p的作用,结果显示miR-483-5p抑制剂能够显著下调肺癌细胞的侵袭和迁移能力(P<0.05)。(4)过表达miR-483-5p增强肺癌转移能力为了进一步研究在体内miR-483-5p对肺癌转移能力的影响,我们构建了GFP标记的稳定表达miR-483-5p的肺癌细胞系。为了检测miR-483-5p过表达对始发部位肿瘤侵袭能力影响,我们将肺癌细胞稳定表达株注射到裸鼠皮下,25天后HE染色检测肿瘤边缘形态,结果显示稳定过表达miR-483-5p的肺癌细胞形成的肿瘤边缘不清晰,部分肿瘤细胞侵袭到肌肉中,而对照的肺癌细胞形成的肿瘤边缘光滑,未见侵袭至肌肉层。因此miR-483-5p的过表达促进肿瘤的原位侵袭。为了检测miR-483-5p过表达对进入血液的肿瘤细胞侵袭能力的影响,我们将肺癌细胞稳定表达株注射到裸鼠尾静脉内,55天后将肺整体取出在活体成像系统中观察肺转移情况。在激发光的激发下,GFP标记的肺癌细胞形成的转移肿瘤发出绿色荧光,结果显示稳定过表达miR-483-5p的A549细胞形成的肺转移数量显著高于对照组(P<0.05)。同时,HE染色的结果印证了荧光观察到的结果,结果显示稳定过表达miR-483-5p的A549细胞形成的肺转移数量高于对照组。(5) miR-483-5p的功能受到抑制后,肺癌转移能力下降为了进一步研究在体内抑制miR-483-5p对肺癌转移能力的影响,我们构建了GFP标记的miR-483-5p受到稳定抑制的肺癌细胞系。为了检测抑制miR-483-5p对始发部位肿瘤侵袭能力影响,我们将稳定抑制miR-483-5p的肺癌细胞注射到裸鼠皮下,35天后HE染色检测肿瘤边缘形态,结果显示与对照相比,稳定抑制miR-483-5p的肺癌细胞形成的肿瘤边缘光滑,未见肿瘤细胞侵袭到肌肉中。为了检测抑制miR-483-5p对进入血液的肿瘤细胞侵袭能力的影响,我们将miR-483-5p受到稳定抑制的A549细胞注射到裸鼠尾静脉内,65天后将肺整体取出在活体成像系统中观察肺转移情况。在激发光的激发下,GFP标记的肺癌细胞形成的转移肿瘤发出绿色荧光。结果显示miR-483-5p受到稳定抑制的A549细胞形成的肺转移数量显著少于对照组(P<0.05)。同时,HE染色的结果印证了荧光观察到的结果,miR-483-5p受到稳定抑制的A549细胞形成的肺转移数量显著高于对照组。(6)在肺癌组织中miR-483-5p表达高于癌旁,并与肿瘤分期正相关为了进一步研究在miR-483-5p与肺癌转移的关系,我们应用组织芯片分析了miR-483-5p与肺癌病理参数的关系。含有75例福尔马林固定石蜡包埋的肺癌组织的组织芯片的原位杂交结果显示,肺癌组织中miR-483-5p的表达高于癌旁,恶性肿瘤中的表达高于良性肿瘤组织中的表达(P<0.05)。2 miR-483-5p促进肺癌转移的机制研究(1) RhoGDIl和ALCAM是miR-483-5p的靶点寻找miRNA的下游靶基因,是研究miRNA作用机制的关键。我们结合生物信息学和蛋白双向电泳两种策略筛选miR-483-5p的潜在靶点。首先,分别应用TargetScan、PicTar和miRanda靶基因预测软件筛选靶基因。结合miR-483-5p的功能,我们筛选到7个抑制肿瘤转移的基因,分别是ALCAM, FOXJ2、FOXO3、 RhoGDI1、NDRG2、SOX11和TFAP2B。其次,我们应用蛋白双向电泳,寻找转染miR-483-5p mimics后A549细胞中受到下调最显著的蛋白。结果显示,与转染NC的A549细胞相比,ALCAM和RhoGDI1表达量在转染miR-483-5p的A549细胞中下降最多。为了验证这些基因是否是miR-483-5p的直接靶点,我们进行了荧光素酶报告基因实验。结果显示含有ALCAM和RhoGDI1野生型3’端非编码区的报告基因载体的荧光素酶活性在转染miR-483-5p后有显著的下降(P<0.05),而其它靶基因没有显著下降(P>0.05)。这一结果初步显示ALCAM和RhoGDI1是miR-483-5p的直接靶点。然后,我们将含有ALCAM突变型3’端非编码区的报告基因载体进行荧光素酶活性检测,结果显示转染miR-483-5p的mimic与其阴性对照相比,荧光素酶活性没有显著变化(P>0.05)。由于RhoGDI1的3’端非编码区含有两个miR-483-5p结合的潜在位点,我们将这两个位点分别突变,荧光素酶活性检测结果显示,荧光素酶活性升高。将这两个位点同时突变,荧光素酶活性检测结果显示,转染miR-483-5p的mimic与其阴性对照相比,荧光素酶活性没有显著变化(P>0.05)。免疫印迹的结果显示,转染miR-483-5p后,RhoGDIl和ALCAM的表达量下调,而转染miR-483-3p没有这一效应。此外,下调miR-483-5p后,RhoGDI1和ALCAM的表达量上升。Rac1和Cdc42的活性受到RhoGDI1的抑制,而转染miR-483-5p后,肺癌细胞中活化状态的Rac1和Cdc42含量升高。因此,荧光素酶报告基因实验和免疫印迹的结果都说明RhoGDI1和ALCAM是miR-483-5p的靶基因。(2) miR-483-5p通过抑制RhoGDI1和ALCAM的表达而提高肺癌细胞侵袭与迁移能力。为了明确miR-483的功能靶基因,我们分别应用特异性的小干扰RNA和过表达质粒下调或上调肺癌细胞RhoGDI1和ALCAM的表达,应用Transwell实验检测了RhoGDI1和ALCAM对肺癌细胞侵袭能力的影响。结果显示,干扰RhoGDI1或ALCAM后,肺癌细胞A549的侵袭能力增强(P<0.05),而干扰RhoGDI1对A549细胞侵袭能力增加高于干扰ALCAM。过表达RhoGDI1或ALCAM后,肺癌细胞A549的侵袭能力下降(P<0.05),而过表达RhoGDI1对A549细胞侵袭能力的抑制高于干扰ALCAM。此外,过表达ALCAM能够部分逆转miR-483-5p对A549细胞侵袭能力的影响,而过表达RhoGDI1能够完全逆转miR-483-5p对A549细胞侵袭能力的影响。上述研究表明,miR-483-5p通过抑制RhoGDI1和ALCAM的表达而提高肺癌细胞侵袭与迁移能力,而对RhoGDI1的抑制可能起到主导作用。(3) miR-483-5p通过抑制RhoGDI1诱导肿瘤细胞发生EMT。干扰RhoGDI1后A549细胞的形态变得瘦长,呈梭形,这与miR-483-5p的作用一致。而干扰ALCAM后,A549细胞形态没有显著变化。此外,过表达RhoGDI1能够逆转miR-483-5p对A549细胞形态的改变。Snail是EMT过程中的关键转录因子。免疫印迹的结果显示,转染miR-483-5p后Snail的表达量升高,我们推测miR-483-5p通过上调Snail进而促进EMT。与转染miR-483-5p类似,干扰RhoGDI1后A549细胞的间质细胞标志分子N-cadherin表达升高,而上皮细胞标志分子E-cadherin表达下降,EMT相关的关键转录因子Snail的表达量上升。这样,我们首次发现下调RhoGDI1能够促进EMT,而这一作用可能是通过上调Snail起作用。综上,RhoGDI1可能是miR-483-5p促进肿瘤转移的关键分子。(4)在肺癌细胞中miR-483-5p受到WNT/β-catenin信号的调控。我们改变肺癌细胞中WNT/β-catenin信号的强弱,然后应用实时荧光定量PCR的方法检测WNT/β-catenin信号的变化对用miR-483-5p表达的影响。首先,我们应用GSK3β的抑制剂氯化锂处理A549细胞,以从而抑制β-catenin的降解,进而增加肺癌细胞中β-catenin的蛋白量。实时实时荧光定量PCR的结果显示,氯化锂处理36小时后,miR-483-5p的量显著升高(P<0.05)。这一结果说明增强WNT/β-catenin信号能够提高肺癌细胞中miR-483-5p的量。其次,我们转染小干扰RNA至肺癌细胞中以减少β-catenin的蛋白量。荧光定量的结果显示,β-catenin被敲低后,miR-483-5p的表达量也下降(P<0.05)。侵袭实验的结果显示,β-catenin的下调能够降低肿瘤细胞的侵袭能力,而转染miR-483-5p后能够逆转A549细胞侵袭能力的减弱。上述实验表明,在肺癌细胞中miR-483-5p受到WNT/β-catenin信号的调节,而miR-483-5p可能在WNT/β-catenin信号促进肿瘤转移过程中发挥重要作用。(5)肺癌组织中miR-483-5p信号与RhoGDIl和ALCAM负相关。为了研究miR-483-5p与两个靶基因的关系,我们应用免疫组化方法检测分析在肺癌组织中ALCAM和RhoGDI1与miR-483-5p的关系。结果显示,肺癌组织中ALCAM和RhoGDI1信号强弱的空间分布上与miR-483-5p信号相反,进一步对75例肺癌组织ALCAM和RhoGDI1信号强弱的统计分析发现,miR-483-5p分别与ALCAM和RhoGDI1信号强弱呈现负相关(P<0.05)。三、结论本研究中,我们首次揭示了miR-483在肿瘤转移过程中的作用及其调节机制。我们发现在肺癌组织中miR-483-5p高表达,且恶性肿瘤中的表达量高于良性肿瘤。在肺癌细胞中miR-483-5p受到WNT/β-catenin信号的调控。miR-483-5p通过抑制其靶基因RhoGDI1和ALCAM,进而提高肺癌细胞侵袭和迁移,促进EMT的发生,最终促进肺癌转移。此外,我们首次发现下调RhoGDI1能够导致Snail的升高,进而使肿瘤细胞表现出EMT的表型。这些发现揭示了miR-483在肿瘤转移过程中的作用及其机制,并为RhoGDI1在肿瘤转移中的作用提供了新机制。肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的首要原因,我们的研究将为临床防治肿瘤提供参考。