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C9是补体溶解途径膜攻击复合体的一个成员。穿孔素是主要存在于自然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞细胞毒颗粒中的一种糖蛋白,两个分子都可以聚合形成环状结构插入靶细胞膜导致细胞溶解,具有结构和功能的相似性。本研究对草鱼Ctenopharyngodon idellus补体C9(grass carp C,gcC9)和穿孔素(grass carpperforin,gcPFP)基因进行了克隆鉴定和特征分析。使用RACE方法扩增得到gcC9的cDNA全长2123 bp,开放阅读框包含1953bp,编码650个氨基酸,理论分子量71.045 kDa。结构域搜索和多序列比对显示gcC9含有血小板反应素(thrombospondin domain,TSP)、低密度脂蛋白受体(lowdensity lipoprotein receptor class A,LDL-R)、表皮生长因子前体(epidermal growthfactor precursor,EGFP)和与穿孔素相关的MACPF结构域。使用PCR和染色体步移法获得gcC9基因全长7003 bp,包含11个外显子和10个内含子,启动子区域822 bp,含有一个典型的TATA框及C/EBP,HSF,NF-AT,CHOP-C,HNF-3B,GATA-2,IK-2,EVI-1,AP-1,CP2和Oct-1等潜在的转录因子结合位点。RT-PCR和实时荧光定量PCR显示gcC9在草鱼未受精卵中已表达,受精后48 h gcC9表达量达到峰值。使用pQE-30载体对gcC9进行原核表达,获得重组蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,Western免疫印迹和RT-PCR显示gcC9在健康草鱼肝脏、肠道、脾脏、头肾、中肾、胸腺、皮肤、肌肉、鳃、心脏、脑和血液中表达,其中肝脏中表达量最高。实时荧光定量PCR分析显示经灭活的柱状黄杆菌Flavobacterium columnare诱导后1 d和7 d gcC9转录分别在肝脏和脾脏中有显著上调;Poly I:C诱导后1 d和3 d,在脾脏、肝脏和头肾中显著上调。使用简并引物扩增得到gcPFP-1和gcPFP-2的两个片段,使用RACE扩增获得gcPFP-1 cDNA全长2514 bp,开放阅读框包含1767 bp,编码588个氨基酸;gcPFP-2 cDNA全长2254 bp,其中开放阅读框1740 bp,编码579个氨基酸。gcPFP-1和gcPFP-2氨基酸相同率为58%,结构预测显示都存在MACPF和C2的PFP的特征结构域。gcPFP-1和gcPFP-2基因全长分别是4090 bp和3059 bp,均由4个外显子和3个内含子组成。RT-PCR显示gcPFP-1和gcPFP-2转录本在健康草鱼被检组织中都有分布,在草鱼早期发育阶段两个基因都在孵化后6 h开始表达,48 h表达量达到峰值,之后表达下降,呈现相同的表达规律。蛋白免疫印迹显示gcPFP-1和gcPFP-2可以交叉识别兔抗gcPFP抗体,草鱼组织中gcPFP-1和gcPFP-2均为68 kDa左右的蛋白,在健康草鱼组织中呈组成型表达。灭活的柱状黄杆菌诱导后7 d,在脾脏和头肾中gcPFP-1和gcPFP-2表达上调;Poly I:C诱导后1 d在脾脏,诱导后3 d在头肾和肠道中检测到gcPFP-1和gcPFP-2表达上调。两种诱导剂作用后3 d,肝脏中gcPFP-1表达上调而gcPFP-2表达下调。GcC9和gcPFP结构相关,氨基酸序列同源性为22%,共同含有MACPF和富含半胱氨酸的EGFP结构域,这些区域具有使蛋白构成跨膜通道和单体多聚化的功能。本研究首次提出鱼类穿孔素存在多种亚型,斑马鱼Danio rerio、黑青斑河豚Tetraodon nigroviridis和三棘刺鱼Gasterosteus aculeatus等鱼类模式生物基因组数据库信息支持该论点,推测穿孔素多态性是硬骨鱼类进化过程中基因组复制的结果。