目的探索芍药苷与芍药甘草汤镇痛作用的相关性,为中药(复方)药效物质基础的研究,有效成分的确定提供新的思路,并为同类复方的体内代谢、作用靶点寻找等研究提供新的技术与方法。1.制备灵敏度高、特异性强的芍药苷单克隆抗体,建立芍药苷免疫分析法,为后续研究提供可靠工具。2.应用在小鼠血中建立的芍药苷酶联免疫分析方法研究体内不同剂量甘草酸对芍药苷药代动力学的影响。3.制备芍药苷免疫亲和色谱柱,优化敲除、洗脱条件,建立从芍药甘草汤中特异性敲除芍药苷的技术方法,并制备芍药甘草汤敲除样品。4.探索不同芍药苷含量的芍药甘草汤对全方镇痛作用及生物学指标的影响,解析芍药苷对芍药甘草汤镇痛作用的贡献度。方法1.高碘酸钠法合成芍药苷人工抗原,应用紫外分光光度法及薄层色谱法对合成的人工抗原进行鉴定。皮下多点多次免疫BALB/c雌性小鼠,ELISA法测定免疫小鼠血清抗体效价及特异性,确定免疫成功后,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经阳性筛选,单克隆化培养后,筛选出能够稳定分泌特异性强、灵敏度高的芍药苷抗体的单克隆细胞株,通过腹水诱导法进行抗体的大量制备,应用辛酸法纯化抗体,SDS-PAGE鉴定纯化后抗体纯度,ELISA法测定抗体效价及特异性。应用该抗体建立灵敏度高、特异性强的芍药苷酶联免疫分析方法及荧光免疫分析方法,并对此两种方法进行比较。应用芍药苷酶联免疫分析方法测定不同经方中芍药苷含量。2.在小鼠血清中建立芍药苷酶联免疫分析方法,用于体内不同剂量甘草酸对芍药苷药代动力学影响的研究。3.将芍药苷单克隆抗体作为配体偶联在固相载体溴化氢活化的琼脂糖凝胶4B上,检测偶联率,制备芍药苷免疫亲和色谱柱,优化敲除、洗脱条件,建立芍药苷敲除法,制备芍药甘草汤中敲除芍药苷的样品。4.制备冰醋酸致痛小鼠模型,比较高中低剂量芍药甘草汤(Shaoyao Gancao decoction,SGD)及具有不同含量芍药苷的芍药甘草汤(SGD-50%PF. SGD-100%PF、SGD-150%PF、 SGD-200%PF)的镇痛作用和相关生物学指标的变化。结果1.经紫外分光光度法及薄层色谱法鉴定,成功合成了芍药苷人工抗原,免疫小鼠的抗血清效价在1：8000-1：32000之间,经细胞融合,克隆化培养最终筛选出了能够稳定分泌特异性强、灵敏度高的芍药苷抗体的单克隆细胞株,经腹水诱导法扩大培养后,制备的抗体以辛酸纯化后,应用SDS-PAGE鉴定的结果表明纯化过程除去了大量杂质蛋白,纯度得到了大幅度提高。纯化前后腹水效价均在1：60000左右,表明纯化过程未对腹水活性造成影响。应用纯化后的抗体建立的芍药苷酶联免疫分析法,灵敏度(IC50值)为42.72ng/mL,最低检测限为4.75ng/mL。与其同分异构体的芍药内酯苷的交叉反应<0.27%,与其他常配伍应用的中药化合物均无明显交叉反应(<0.01%)。该方法与高效液相色谱法对样品的检测结果相关性好,相关系数为R2=0.9929。应用该方法测定的不同经方中芍药苷的含量结果表明,配伍不同的药味,对于芍药苷的溶出具有不同的影响,部分复方配伍后促进了芍药苷的溶出,如柴胡桂枝汤、大柴胡汤、真武汤、芍药甘草附子汤与单味白芍相比芍药苷含量更多,而附子汤中芍药苷含量减少。其余方剂如麻子仁丸、桂枝汤、黄芩汤、四逆散、芍药甘草汤与白芍中的芍药苷煎煮后含量相当。应用该抗体所建立的芍药苷荧光免疫分析方法,灵敏度较酶联免疫分析方法,得到了大幅的提高,ICso值为2.20ng/mL,最低检测限为0.004ng/mL。并且板内、板间差均在6.67%以内,具有良好的精密度。2.应用在小鼠血清中建立的芍药苷酶联免疫分析方法,检测不同甘草酸剂量对芍药苷药代动力学的影响,结果表明,在芍药甘草汤及四逆散配方中,随甘草酸剂量的增加,芍药苷的血药浓度,曲线下面积逐渐降低,但在体内的平均滞留时间有所延长。3.成功制备了芍药苷免疫亲和色谱柱,并对敲除、洗脱条件进行了优化,最终选择应用去离子水作为敲除缓冲液,0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液作为洗脱缓冲液,且流速均控制在2mL/min。该免疫亲和色谱柱的抗体偶联率为99%,偶联比为2.3mg/mL,柱容量为1.47μg/mL。成功制备了芍药苷的敲除方法,获得了敲除芍药苷的芍药甘草汤样品。4.成功制备了小鼠冰醋酸致痛模型,应用高中低剂量组芍药甘草汤进行干预,结果表明不同剂量组的芍药甘草汤均有镇痛作用,且其镇痛作用随芍药甘草汤剂量的增加逐渐增强。芍药苷单体同样具有显著的镇痛作用。当中剂量组芍药甘草汤中芍药苷含量在50%-150%这个范围时,随着芍药苷含量的增加,模型小鼠扭体抑制率逐渐降低,即镇痛作用逐渐下降,但当芍药苷含量达到200%时,扭体抑制率出现明显增强。经过取血检测,模型组小鼠血清中PGE2、cAMP、NO含量明显高于空白组,相同模型下阳性药(阿司匹林)组、芍药苷(PF)组、SGD-50%PF、SGD-100%PF、SGD-150%PF、SGD-200%PF组与模型组比较均有不同程度的降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。在SGD-50%PF、 SGD-100%PF、SGD-150%PF三组中,随芍药苷含量的增加,小鼠血清中PGE2、cAMP、NO含量亦随之增多,差异具有统计学意义(P<0.05),但当芍药苷含量进一步增多时,即SGD-200%PF组中,实验小鼠血清中PGE2、cAMP含量低于SGD-150%PF组(P<0.05),其中PGE2含量与SGD-100%PF组相当,而cAMP含量高于SGD-100%PF组(P<0.05),SGD-200%PF组中NO含量与SGD-100%PF组、SGD-150%PF组比较无明显差异(P>0.05),但高于SGD-50%PF组(P<0.05)。PF组与SGD-100%PF含有等量的芍药苷,但PF组中实验动物血清中PGE2、cAMP含量低于SGD-100%PF组(P<0.05),NO含量与SGD-100%PF组相当。超氧化物歧化酶(SOD)在不同处理组中活力各有不同,与SGD-100%PF含有等量的芍药苷单体对SOD的活力并无促进作用,与模型组比较无明显差异(P>0.05),但整体复方,即SGD-100%PF对SOD确有显著的促进作用。且随着复方中芍药苷含量的升高,即SGD-50%PF、SGD-100%PF、SGD-150%PF、 SGD-200%PF组中SOD活力也有逐渐增强的趋势。与SGD-50%PF组比较,SGD-150%PF、 SGD-200%PF组中SOD活力均有显著升高。结论本研究制备的芍药苷单克隆抗体特异性强,亲和力高,与以往报道的芍药苷单克隆抗体性质不同,属不同抗体。基于该抗体所建立的酶联免疫分析法与荧光免疫分析方法灵敏度高,较之传统的液相色谱检测技术更加简便快捷,可用于芍药苷在生物样品中的微量检测。应用芍药苷免疫分析方法研究的不同剂量甘草酸对芍药苷药代动力学影响的结果表明,在不同复方配伍环境中,高剂量甘草酸抑制了芍药苷的吸收。基于芍药苷单克隆抗体制备的芍药苷免疫亲和色谱柱,成功的敲除了芍药甘草汤中的芍药苷,比较芍药苷不同含量的芍药甘草汤及芍药苷单体的镇痛作用结果表明,芍药苷是芍药甘草汤中影响镇痛作用的重要影响因素,贡献度很大,但并非是唯一影响因素,芍药甘草汤中,芍药苷的镇痛机制可能与调节PGE2、cAMP、NO分子相关。但对SOD酶活力的影响不起主要作用。